Analyse af Cellesuspensioner isoleret fra Solid Væv af Spectral flowcytometri
Summary
Denne artikel beskriver spektrale cytometri, en ny tilgang i flowcytometri, der bruger figurer af emission spektre til at skelne fluorokromer. En algoritme erstatter kompensationer og kan behandle auto-fluorescens som en selvstændig parameter. Denne nye tilgang giver mulighed for en korrekt analyse af celler isoleret fra faste organer.
Abstract
Flowcytometri har været brugt i de sidste 40 år til at definere og analysere fænotypen af lymfoide og andre hæmatopoietiske celler. Oprindeligt begrænset til analysen af et par fluorochromer, der i øjeblikket er der snesevis af forskellige fluorescerende farvestoffer, og op til 14-18 forskellige farvestoffer kan kombineres på et tidspunkt. Men flere begrænsninger stadig forringe de analytiske evner. På grund af mangfoldigheden af fluorescerende prober, er dataanalyse blevet mere komplekse på grund af behovet for store, multi-parametriske kompensation matricer. Desuden har mutante musemodeller bærer fluorescerende proteiner til at afsløre og spore specifikke celletyper i forskellige væv bliver tilgængelige, så kræves analysen (ved flowcytometri) af auto-fluorescerende cellesuspensioner opnået fra faste organer. Spectral flowcytometri, hvilket adskiller formerne af emissionsspektre langs en lang række kontinuerte bølgelængder, løser nogle af disse problemer. Dataene analyseres wed en algoritme, der erstatter kompensation matricer og behandler automatisk fluorescens som en selvstændig parameter. Således bør spektral flowcytometri være stand til at skelne fluorochromer med lignende toppe emissions- og kan tilvejebringe en multi-parametrisk analyse uden kompensation krav.
Denne protokol beskriver den spektrale flowcytometrianalyse, giver mulighed for en 21-parameter (19 fluorescerende prober) karakterisering og forvaltningen af en auto-fluorescerende signal, der giver høj opløsning i mindre population detektion. Resultaterne præsenteret her viser, at spektral flowcytometri viser fordele i analysen af cellepopulationer fra væv vanskelige at karakterisere på konventionel flowcytometri, såsom hjertet og tarmen. Spectral flowcytometri således demonstrerer den multi-parametrisk analytiske kapacitet højtydende konventionel flowcytometri uden kravet om erstatning og muliggør automatisk fluorescens forvaltning.
Introduction
I de sidste par årtier, flowcytometri (FCM) blev en alment tilgængelig analysemetode afgørende for celle Fænotypebestemmelse undersøgelser. Der har været en betydelig stigning i de tilgængelige fluorescerende farvestoffer, især fluorochromer ophidset af violet laser (405 nm) (fx Brilliant Violet og nye Q-prik farvestoffer). Men væksten af tilgængelige fluorescerende farvestoffer øger risikoen for overlappende emissioner, og kræver arbejdskraftintensive kompensation matricer. FCM blev udbredt at analysere cellesuspensioner fra fast væv, men tilstedeværelsen af auto-fluorescerende celler begrænser diskrimination af specifikt mærkede populationer.
De grundlæggende principper for spektral FCM er rapporteret i detaljer i Futamura et al. 1, 2. Kort fortalt er den spektrale FCM anvendt her (se tabellen af materialer) udstyret med 405, 488, og 638 nm lasere. Den spektrale FCM indfanger alle den udsendte fluorescence som spektre i en 32-kanals lineær opstilling PMT (32ch PMT) til 500 nm til 800 nm og 2 uafhængige PMT'er til 420 nm til 440 nm og 450 nm til 469 nm, som erstatter de konventionelle båndpasfiltre. De 488 og 405/638 nm laser spots er rumligt adskilt, mens de 405 nm og 638 nm laser pletter er co-lineære. For hver enkelt partikel, de spektrale FCM måler op til 66 kanaler af fluorescensdata exciteres af den 405 nm og 488 nm lasere. Når celler ophidset ved 638 nm laser, den spektrale FCM måler 58 kanaler af fluorescensdata fordi en maske er indsat for at forhindre 638 nm laser fra skinner ind PMT. Spectral FCM analyserer de erhvervede hele spektret data med en algoritme baseret på den vægtede mindste kvadraters metode (WLSM), som muliggør adskillelse af overlappende fluorescerende spektre. Spectra afledt fra enkelt-farvede og ufarvede prøver anerkendt som den grundlæggende referencespektrer. Multi-farvede prøver matematisk monteret ennd ublandet, og spektret af en prøve med blandede fluorescerende mærker nedbrydes til en samling af det konstituerende spektre. Den unmixing, i spektral teknologi 3, 4, erstatter den kompensation, fjerner signalet fra alle detektorer undtagen den måle en given farvestof.
I denne undersøgelse har vi kombineret og testet 19 fluorochromer i en enkelt, 21-parameter analyse, kendetegnet de store hæmatopoietiske delmængder fundet i musemilt. Derudover demonstrerede vi, at den spektrale cytometri kan administrere auto-fluorescerende signal og dermed forbedre karakterisering af intestinale intra-epitheliale lymfocytter og af den embryoniske hjerte. Faktisk, i disse væv, auto-fluorescens forvaltning tillod tildelingen af specifik fluorescens til celler, der ville blive udelukket fra analysen på konventionel FCM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konventionel FCM er baseret på påvisning af fotoner udsendt efter excitation af fluorescerende prober. Fluorescensemissionen af et fluorokrom detekteret i en detektor beregnet til at måle signalet fra en anden fluorokrom inducerer fysisk overlap. Denne spillover blandt emissionsspektre skal korrigeres ved kompensationer.
Spektral FCM og databehandling af unmixing deconvolution algoritme gør det muligt for kombinationen af fluorokromer med tætte emission toppe uden yderligere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender de tekniske og teoretiske bidrag i spektral cytometri af K. Futamura, som også kritisk revision manuskriptet. Vi er også i gæld til C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, og P. Pereira til kritisk læsning af manuskriptet og for endeløse teknisk rådgivning og støtte. Vi takker også P. Pereira for gaven af anti Vγ7-APC og Vδ4-biotin mærkede antistoffer. Vi akundskab Center d'Enseignements fra Pasteur Instituttet for indbydende og støtte filme logistik. Dette arbejde blev støttet af Pasteur Instituttet, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); den schweiziske National Science Foundation og Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para en Ciência ea Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); og Université Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR) projekt Twothyme, ANR, og programmet REVIVE (investering i fremtiden) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. “String theory” of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
