Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux
Summary
Cet article décrit la cytométrie spectrale, une nouvelle approche en cytométrie de flux qui utilise les formes des spectres d'émission pour distinguer fluorochromes. Un algorithme remplace compensations et peut traiter auto-fluorescence comme un paramètre indépendant. Cette nouvelle approche permet l'analyse correcte des cellules isolées à partir d'organes solides.
Abstract
cytométrie de flux a été utilisé pour les 40 dernières années pour définir et analyser le phénotype de lymphoïdes et d'autres cellules hématopoïétiques. Dans un premier temps limité à l'analyse de quelques fluorochromes, actuellement il y a des dizaines de différents colorants fluorescents, et jusqu'à 14-18 colorants différents peuvent être combinés à la fois. Cependant, plusieurs limitations portent encore atteinte à la capacité d'analyse. En raison de la multiplicité des sondes fluorescentes, l'analyse des données est devenue de plus en plus complexe en raison de la nécessité de grandes matrices de compensation multi-paramétrique. En outre, des modèles de souris mutantes portant des protéines fluorescentes pour détecter et oligo-types de cellules spécifiques dans différents tissus sont devenus disponibles, l'analyse (par cytométrie de flux) de suspensions de cellules auto-fluorescence obtenues à partir d'organes solides est nécessaire. Spectral cytométrie de flux, ce qui distingue les formes des spectres d'émission le long d'une large gamme de longueurs d'onde continue, traite certains de ces problèmes. Les données sont analysées wvec un algorithme qui remplace les matrices de compensation et traite auto-fluorescence comme un paramètre indépendant. Ainsi, la cytométrie de flux spectral doit être capable de distinguer fluorochromes avec des pics d'émission similaires et peut fournir une analyse multi-paramétrique sans exigences de compensation.
Ce protocole décrit l'analyse de cytométrie de flux spectral, ce qui permet un 21 paramètre (19 sondes fluorescentes) la caractérisation et la gestion d'un signal d'auto-fluorescent, fournissant une haute résolution dans la détection de la population mineure. Les résultats présentés ici montrent que le flux spectral présente cytométrie avantages dans l'analyse des populations cellulaires des tissus difficiles à caractériser en cytométrie de flux classiques, tels que le cœur et l'intestin. cytométrie de flux spectral démontre ainsi la capacité d'analyse multi-paramétrique offrant un rendement élevé cytométrie de flux classique, sans l'exigence de compensation et permet la gestion automatique de la fluorescence.
Introduction
Au cours des dernières décennies, la cytométrie de flux (FCM) est devenu une méthode d'analyse largement disponible essentielle pour les études de phénotypage cellulaire. Il y a eu une augmentation substantielle des colorants fluorescents disponibles, en particulier des fluorochromes excités par le laser violet (405 nm) (par exemple, Violet brillant et nouveaux colorants Q-dot). Cependant, la croissance des colorants fluorescents disponibles augmente le risque d'émissions qui se chevauchent et nécessite des matrices de compensation de main-d'œuvre. La FCM est devenu largement utilisé pour analyser des suspensions de cellules de tissu solide, mais la présence de cellules auto-fluorescence limite la discrimination des populations spécifiquement marquées.
Les principes de base de la FCM spectrale sont décrites en détail dans Futamura et al. 1, 2. En bref, la FCM spectrale utilisée ici (voir la table des matières) est équipé de 405, 488, et les lasers 638 nm. La FCM spectrale capture toutes les f émisluorescence comme des spectres dans un de 500 nm à 800 nm et 2 PMT indépendants pour 420 nm à 440 nm et de 450 nm à 469 nm, respectivement, qui remplacent les filtres passe-bande classiques réseau linéaire PMT (32CH PMT) 32 canaux. Les 488 et les spots laser 405/638 nm sont séparés dans l'espace, tandis que les 405 nm et 638 nm spots laser sont colinéaires. Pour chaque particule individuelle, les mesures spectrales de la FCM jusqu'à 66 canaux de données de fluorescence excité par le 405 nm et 488 nm lasers. Lorsque les cellules sont excités par le laser 638 nm, la mesure spectrale FCM 58 canaux de données de fluorescence en raison d'un masque est inséré pour empêcher le laser 638 nm de briller dans le PMT. Spectral FCM analyse les données acquises à spectre complet avec un algorithme basé sur la méthode des moindres carrés pondérée (WLSM), ce qui permet la séparation du chevauchement des spectres de fluorescence. Spectra dérivé à partir des échantillons mono-colorées et non colorées sont reconnus comme étant les spectres de référence de base. échantillons multi-colorés sont mathématiquement équipés d'unnd mélange, et le spectre d'un échantillon avec des marqueurs fluorescents mixtes est décomposé en un ensemble de ses spectres constituant. La déconvolution, dans la technologie spectrale 3, 4, remplace la compensation qui élimine les signaux de tous les détecteurs , à l' exception d' une mesure d' un colorant donné.
Dans cette étude, nous avons combiné et testé 19 fluorochromes en une seule analyse 21 paramètres qui caractérisait les principaux sous-ensembles de hématopoiétiques trouvés dans la rate de la souris. De plus, nous avons démontré que la cytométrie spectrale peut gérer le signal auto-fluorescent, améliorant ainsi la caractérisation des lymphocytes intra-épithéliales de l'intestin et du cœur embryonnaire. En effet, dans ces tissus, la gestion auto-fluorescence permis pour l'attribution de la fluorescence spécifique des cellules qui seraient exclues de l'analyse de la FCM conventionnelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
FCM classique est basée sur la détection des photons émis après l'excitation des sondes fluorescentes. L'émission de fluorescence d'un fluorochrome détecté dans un détecteur conçu pour mesurer le signal d'un autre fluorochrome induit chevauchement physique. Ce débordement entre les spectres d'émission doit être corrigée par des compensations.
FCM spectrale et le traitement de données par l'algorithme de déconvolution de démélange permet la combinaison…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons les contributions techniques et théoriques en cytométrie spectrale de K. Futamura, qui a également révisé critique du manuscrit. Nous sommes également redevables à C. Ait-Mansour, P.-H. Commère, A. Bandeira et P. Pereira pour la lecture critique du manuscrit et des conseils techniques sans fin et de soutien. Nous remercions également P. Pereira pour le don des anticorps anti-Vγ7 APC et Vδ4-Biotin marqués. Nous informons l'Centre d'Institut Pasteur de Enseignements pour l'accueil et le soutien logistique de tournage. Ce travail a été soutenu par l'Institut Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); la Fondation nationale des sciences suisse et Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); et de l'Université Paris Diderot, le projet Agence Nationale de la Recherche (ANR) Twothyme, l'ANR et le Programme REVIVE (Investissement pour l'avenir) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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