स्पेक्ट्रल प्रवाह cytometry द्वारा ठोस ऊतकों से पृथक सेल निलंबन का विश्लेषण
Summary
यह लेख वर्णक्रमीय cytometry, फ्लो में एक नया दृष्टिकोण उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के आकार का उपयोग करता है fluorochromes भेद करने के लिए वर्णन करता है। एक एल्गोरिथ्म मुआवजा बदल देता है और एक स्वतंत्र पैरामीटर के रूप में ऑटो प्रतिदीप्ति इलाज कर सकते हैं। ये नवीन दृष्टिकोण ठोस अंगों से अलग कोशिकाओं के समुचित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।
Abstract
प्रवाह cytometry को परिभाषित करने और लसीकावत् और अन्य hematopoietic कोशिकाओं के phenotype विश्लेषण करने के लिए पिछले 40 वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है। शुरू में कुछ fluorochromes के विश्लेषण के लिए प्रतिबंधित है, वर्तमान में वहाँ विभिन्न फ्लोरोसेंट रंजक के दर्जनों रहे हैं, और अप करने के लिए 14-18 अलग अलग रंगों में एक समय में जोड़ा जा सकता है। हालांकि, कई सीमाएं अभी भी विश्लेषणात्मक क्षमताओं ख़राब। फ्लोरोसेंट जांच की बहुलता के कारण, डेटा विश्लेषण बड़े, बहु पैरामीट्रिक मुआवजा मैट्रिक्स की जरूरत की वजह से जटिल हो गया है। इसके अलावा, उत्परिवर्ती माउस फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने और विभिन्न ऊतकों में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं का पता लगाने के ले जाने के मॉडल उपलब्ध हो गए हैं, इसलिए विश्लेषण ऑटो फ्लोरोसेंट सेल ठोस अंगों से प्राप्त निलंबन की (फ्लो द्वारा) की आवश्यकता है। वर्णक्रमीय प्रवाह cytometry, जो निरंतर तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के आकार अलग करती है, इनमें से कुछ समस्याएं संबोधित करते हैं। डेटा w विश्लेषण किया जाता हैएक एल्गोरिथ्म है कि मुआवजा मैट्रिक्स बदल देता है और एक स्वतंत्र पैरामीटर के रूप में ऑटो प्रतिदीप्ति व्यवहार करता है एक रबर। इस प्रकार, वर्णक्रमीय फ्लो समान उत्सर्जन चोटियों के साथ fluorochromes भेदभाव में सक्षम होना चाहिए और मुआवजा आवश्यकताओं के बिना एक बहु पैरामीट्रिक विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं।
यह प्रोटोकॉल cytometry विश्लेषण वर्णक्रमीय प्रवाह का वर्णन करता है, एक 21 पैरामीटर (19 फ्लोरोसेंट जांच) लक्षण वर्णन और एक स्वत: फ्लोरोसेंट संकेत के प्रबंधन के लिए अनुमति देता है, मामूली आबादी का पता लगाने में उच्च संकल्प प्रदान करते हैं। यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि वर्णक्रमीय फ्लो जैसे हृदय और आंत के रूप में cytometry पारंपरिक प्रवाह में चिह्नित करने के लिए मुश्किल ऊतकों, से सेल आबादी के विश्लेषण में लाभ प्रस्तुत करता है। cytometry इस प्रकार प्रवाह वर्णक्रमीय बेहतरीन प्रदर्शन करने वाले मुआवजे के लिए आवश्यकता के बिना cytometry पारंपरिक प्रवाह और सक्षम बनाता है ऑटो प्रतिदीप्ति प्रबंधन की बहु पैरामीट्रिक विश्लेषणात्मक क्षमता को दर्शाता है।
Introduction
पिछले कुछ दशकों में, प्रवाह cytometry (FCM) एक व्यापक रूप से उपलब्ध विश्लेषणात्मक विधि सेल phenotyping के अध्ययन के लिए आवश्यक बन गया। उपलब्ध फ्लोरोसेंट रंजक में पर्याप्त वृद्धि, विशेष रूप से बैंगनी लेजर (405 एनएम) (जैसे, शानदार वायलेट और नए क्यू डॉट रंजक) से उत्साहित fluorochromes हुई है। लेकिन, उपलब्ध फ्लोरोसेंट रंजक के विकास उत्सर्जन ओवरलैपिंग का खतरा बढ़ जाता और श्रम प्रधान मुआवजा मैट्रिक्स की आवश्यकता है। FCM व्यापक रूप से ठोस ऊतकों से सेल निलंबन विश्लेषण किया गया, लेकिन ऑटो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की उपस्थिति विशेष रूप से लेबल आबादी के भेदभाव को सीमित करता है।
वर्णक्रमीय FCM के बुनियादी सिद्धांतों Futamura एट अल में विस्तार से रिपोर्ट कर रहे हैं। 1, 2। संक्षेप में, वर्णक्रमीय यहां इस्तेमाल किया FCM (सामग्री की तालिका देखें) 405, 488, और 638 एनएम लेज़रों के साथ सुसज्जित है। वर्णक्रमीय FCM कब्जा सभी उत्सर्जित च800 एनएम 500 एनएम और 420 एनएम 440 एनएम एनएम क्रमशः के लिए और 450 एनएम 469, के लिए 2 स्वतंत्र PMTs, जो पारंपरिक बैंड-पास फिल्टर की जगह के लिए एक 32-चैनल रैखिक सरणी पीएमटी (32ch पीएमटी) में स्पेक्ट्रा के रूप में luorescence। 488 और 405/638 एनएम लेजर स्पॉट स्थानिक, अलग, जबकि 405 एनएम और 638 एनएम लेजर स्पॉट सह-रैखिक कर रहे हैं। प्रत्येक व्यक्ति के कण के लिए, 405 एनएम से उत्साहित प्रतिदीप्ति डेटा के 66 चैनल और 488 एनएम लेज़रों अप करने के लिए वर्णक्रमीय FCM उपाय। कोशिकाओं 638 एनएम लेजर से उत्साहित कर रहे हैं, वर्णक्रमीय FCM प्रतिदीप्ति डेटा के 58 चैनलों को मापता है क्योंकि एक मुखौटा पीएमटी में चमक से 638 एनएम लेजर को रोकने के लिए डाला जाता है। स्पेक्ट्रल FCM एक एल्गोरिथ्म भारित न्यूनतम वर्ग विधि (WLSM) है, जो फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रा ओवरलैपिंग की जुदाई में सक्षम बनाता है के आधार पर के साथ प्राप्त पूर्ण स्पेक्ट्रम डेटा का विश्लेषण। स्पेक्ट्रा एकल दाग और बेदाग नमूने से प्राप्त बुनियादी संदर्भ स्पेक्ट्रा के रूप में पहचाने जाते हैं। बहु रंगीन नमूने गणितीय लगे हैं एकnd अमिश्रित, और मिश्रित फ्लोरोसेंट लेबल के साथ एक नमूना के स्पेक्ट्रम उसके घटक स्पेक्ट्रा का एक संग्रह में विघटित किया जाता है। Unmixing, वर्णक्रमीय प्रौद्योगिकी 3, 4 में, मुआवजा है कि एक एक दिया डाई को मापने के अलावा सभी डिटेक्टरों से संकेत को हटा बदल देता है।
इस अध्ययन में, हम संयुक्त और एक एकल, 21 पैरामीटर विश्लेषण है कि माउस तिल्ली में पाया प्रमुख hematopoietic सबसेट विशेषता में 19 fluorochromes का परीक्षण किया। साथ ही, हम वर्णक्रमीय cytometry ऑटो फ्लोरोसेंट संकेत प्रबंधन कर सकते हैं, इस प्रकार आंतों के भीतर उपकला लिम्फोसाइट के और भ्रूण दिल के लक्षण वर्णन में सुधार का प्रदर्शन किया। दरअसल, इन ऊतकों में, ऑटो प्रतिदीप्ति प्रबंधन कोशिकाओं के लिए विशिष्ट प्रतिदीप्ति का काम है कि पारंपरिक FCM में विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा के लिए अनुमति दी।
Protocol
Representative Results
Discussion
परम्परागत FCM फ्लोरोसेंट जांच की उत्तेजना के बाद उत्सर्जित फोटॉनों का पता लगाने पर आधारित है। एक fluorochrome एक और fluorochrome से संकेत को मापने के लिए तैयार किया गया एक डिटेक्टर में पाया की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन शार?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम K फुटमुरा, जो भी गंभीर रूप से पांडुलिपि संशोधित के वर्णक्रम cytometry में तकनीकी और सैद्धांतिक योगदान को स्वीकार करते हैं। हम सी ईट-मंसूर, P.-H. को भी आभारी हैं Commere, ए Bandeira, और P पेरीरा समीक्षकों पांडुलिपि पढ़ने के लिए और अंतहीन तकनीकी सलाह और समर्थन के लिए। हम यह भी विरोधी Vγ7-एपीसी और Vδ4-बायोटिन लेबल एंटीबॉडी के उपहार के लिए P पेरीरा धन्यवाद। हम स्वागत करते हुए और फिल्मांकन रसद समर्थन करने के लिए पाश्चर संस्थान से केंद्र डी Enseignements aknowledge। इस काम पाश्चर संस्थान, Institut राष्ट्रीय डे ला Santé एट डी ला Recherche médicale (INSERM) द्वारा समर्थित किया गया था; स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन और पाश्चर Bourse रॉक्स (एस एस); Fundação पैरा एक Ciencia ईए Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (एमवी); और Université पैरिस डिडेरोट, एजेंस नेशनल डे ला Recherche (ANR) परियोजना Twothyme, ANR, और कार्यक्रम पुनर्जीवित (भविष्य के लिए निवेश) (एसी)।
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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