スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析
Summary
この記事では、スペクトルサイトメトリー、蛍光色素を区別するために、発光スペクトルの形状を使用するフローサイトメトリーでの新しいアプローチを説明します。このアルゴリズムは、補償を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うことができます。この新しいアプローチは、固形臓器から単離された細胞の適切な分析が可能になります。
Abstract
フローサイトメトリーを定義し、リンパ系および他の造血細胞の表現型を解析するために、過去40年間使用されてきました。最初は少数の蛍光色素の分析に限定さ、現在、異なる蛍光色素の数十があり、最大14-18異なる色素を一度に組み合わせることができます。しかし、いくつかの制限は、まだ分析能力を損ないます。なぜなら蛍光プローブの多数のデータ解析は、大きな、マルチパラメトリック補償マトリックスの必要性にますます複雑になってきています。また、異なる組織における特定の細胞タイプを検出し、追跡するために蛍光タンパク質を担持する変異マウスモデルが利用可能になっているので、固形臓器から得られる自家蛍光細胞懸濁液の（フローサイトメトリーによる）分析が必要です。連続的な波長の広い範囲に沿って発光スペクトルの形状を区別するれ、フローサイトメトリースペクトル、これらの問題の一部に対処します。データはwが分析され補償行列を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うアルゴリズム番目。したがって、スペクトルフローサイトメトリーは、類似の発光ピークを有する蛍光色素を識別することが可能であるべきであり、補正要件なしに、マルチパラメトリック分析を提供することができます。
このプロトコルは、マイナーな集団検出における高い分解能を提供する、21パラメータ（19個の蛍光プローブ）特徴付けおよび自家蛍光信号の管理を可能にする、サイトメトリー分析スペクトルの流れを説明しています。ここに示す結果は、そのスペクトルフローサイトメトリーを示し、心臓および腸のように、従来のフローサイトメトリーで特徴付けることが困難な組織からの細胞集団の分析における利点を提供します。このように、フローサイトメトリースペクトルは補正を必要とすることなく高性能従来のフローサイトメトリーのマルチパラメトリック分析能力を実証し、自家蛍光の管理を可能に。
Introduction
過去数十年では、フローサイトメトリー（FCM）は、細胞の表現型の研究のために不可欠広く利用可能な分析方法になりました。特に青紫色レーザー（405 nm）を（ 例えば、ブリリアントバイオレット、新たなQ-ドット染料）により励起された蛍光色素、可能な蛍光色素が大幅に増加しています。しかし、利用可能な蛍光色素の成長が重複放出のリスクを増加させ、労働集約的補償行列を必要とします。 FCMは、固形組織から細胞懸濁液を分析に広く使用されるとなったが、自己蛍光細胞の存在は、特異的に標識された集団の識別を制限します。
スペクトルFCMの基本的な原理は、二村らに詳細に報告されています。 1、2。手短に言えば、ここで使用されるスペクトルFCMは（材料の表を参照）405、488、及び638 nmのレーザーを備えています。スペクトルFCMは全て放出されるFを取り込み800 nmの500 nmおよび従来のバンドパスフィルタを交換し、それぞれ440 nmおよび469 nmの450 nmの420 nmのための2つの独立したPMT、32チャネル線形アレイPMT（32CHのPMT）におけるスペクトルとしてluorescence。 405 nmおよび638 nmのレーザースポットが共線形でありながら、488と638分の405 nmのレーザースポットは、空間的に分離されています。各個々の粒子のために、スペクトルFCMは、405 nmおよび488のnmのレーザーによって励起された蛍光データの66チャネルまで測定します。細胞を、638 nmのレーザーによって励起されるときにマスクがPMTに輝くから638 nmのレーザーを防止するために挿入されているので、スペクトルFCMは、蛍光データの58個のチャネルを測定します。スペクトルFCMは、蛍光スペクトルを重複の分離を可能にする加重最小二乗法（WLSM）に基づくアルゴリズムを用いて取得されたフルスペクトルデータを分析します。単染色し、染色されていないサンプルに由来するスペクトルは、基本的な基準スペクトルとして認識されています。マルチ染色したサンプルは、数学的に取り付けられていますND混合されていない、と混合蛍光標識を有する試料のスペクトルは、その構成スペクトルの集合に分解されます。アンミキシングは、スペクトル技術3、4において、所定の染料を測定するものを除くすべての検出器からの信号を除去する補正を置き換えます。
本研究では、合わせて、マウス脾臓に見出される主要な造血サブセットを特徴単一、21パラメータ解析における19の蛍光色素を試験しました。また、我々は、スペクトルサイトメトリーは、このように、腸上皮内リンパ球および胚中心の特性を向上させる、自己蛍光シグナルを管理することができることを実証しました。実際、これらの組織では、自家蛍光の管理は、従来のFCMに分析から除外されることになる細胞に特異的な蛍光の割り当てを可能にしました。
Protocol
Representative Results
Discussion
従来のFCMは、蛍光プローブの励起後に放出された光子の検出に基づいています。別の蛍光色素からの信号を測定するように設計された検出器で検出された1つの蛍光色素の蛍光放出は、物理的な重なりを誘導します。発光スペクトルの中でこの波及は補償によって修正される必要があります。
アンミキシングデコンボリューションアルゴリズムによるスペクトルFCMおよび?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々はまた、批判的に原稿を改訂K・フタミュラ、スペクトルのフローサイトメトリーの技術と理論的な貢献を認めます。我々はC. AIT-マンスール、P.-H.にもお世話になっています批判的に原稿を読み取るためと無限の技術的なアドバイスやサポートのためのCommere、A. Bandeira、およびP.ペレイラ。我々はまた、抗Vγ7-APCとVδ4ビオチン標識抗体の贈り物のためにP.ペレイラに感謝します。私たちは、撮影の物流を歓迎し、支援するためのパスツール研究所からセンターD'Enseignementsをaknowledge。この作品は、パスツール研究所、研究所国立・デ・ラ・サンテら・デ・ラ・RECHERCHEMédicale（INSERM）によってサポートされていました。スイス国立科学財団とパスツールブルスルー（SS）; FundaçãoパラCiênciaEA Tecnologia – SFRH / BD / 2010分の74218（MV）。そして大学パリディドロ、アジャンス国立デラRECHERCHE（ANR）のプロジェクトTwothyme、ANR、およびプログラム（未来のための投資を復活させます）（AC）。
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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