Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral
Summary
Este artigo descreve espectral citometria, uma nova abordagem em citometria de fluxo que usa as formas de espectros de emissão de distinguir fluorocromos. Um algoritmo substitui compensações e pode tratar auto-fluorescência como um parâmetro independente. Esta nova abordagem permite a análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos.
Abstract
A citometria de fluxo foi usada para os últimos 40 anos, para definir e analisar o fenótipo da linfóide e outras células hematopoiéticas. Inicialmente restrita à análise de alguns fluorocromos, atualmente, existem dezenas de diferentes corantes fluorescentes, e até 14-18 corantes diferentes podem ser combinados em um momento. No entanto, várias limitações ainda prejudicar as capacidades analíticas. Devido à multiplicidade de sondas fluorescentes, análise de dados tornou-se cada vez mais complexa devido à necessidade de grandes, matrizes de compensação multi-paramétricos. Além disso, modelos de murganhos mutantes transportando proteínas fluorescentes para detectar e oligo tipos de células específicas em diferentes tecidos tornaram-se disponíveis, por isso, é necessária a análise (por citometria de fluxo) de suspensões celulares de auto-fluorescentes obtidas a partir de órgãos sólidos. Espectrais citometria de fluxo, que distingue as formas de espectros de emissão ao longo de uma ampla gama de comprimentos de onda contínuos, resolve alguns destes problemas. Os dados são analisados wom um algoritmo que substitui matrizes de compensação e trata auto-fluorescência como um parâmetro independente. Assim, citometria de fluxo espectral deve ser capaz de discriminar fluorocromos com picos de emissão semelhantes e pode fornecer uma análise multi-paramétrico, sem exigências de compensação.
Este protocolo descreve o fluxo de citometria espectral análise, permitindo um 21 parâmetro (19 sondas fluorescentes) caracterização e a gestão de um sinal auto-fluorescente, proporcionar alta resolução na detecção população menor. Os resultados aqui apresentados mostram que o fluxo de citometria espectral apresenta vantagens na análise de populações de células a partir de tecidos difíceis de caracterizar em citometria de fluxo convencional, tal como o coração e o intestino. Espectrais citometria de fluxo, assim, demonstra a capacidade de análise multi-paramétrico de gestão de alto desempenho citometria de fluxo convencional, sem a exigência de compensação e permite auto-fluorescência.
Introduction
Nas últimas décadas, a citometria de fluxo (FCM) tornou-se um método analítico amplamente disponível, essencial para estudos de fenótipos celulares. Houve um aumento substancial nos corantes fluorescentes disponíveis, particularmente fluorocromos excitados pelo laser violeta (405 nm) ( por exemplo, Brilliant Violet e novos corantes Q-dot). No entanto, o crescimento de corantes fluorescentes disponíveis aumenta o risco de sobreposição de emissões e requer matrizes de compensação de mão-de-obra intensiva. A FCM tornou-se amplamente utilizada para analisar suspensões de células de tecido sólido, mas a presença de células auto-fluorescentes limita a discriminação de populações especificamente marcadas.
Os princípios básicos da FCM espectral são relatados em detalhe em Futamura et al. 1 , 2 . Resumidamente, o FCM espectral utilizado aqui (ver tabela de materiais) está equipado com lasers 405, 488 e 638 nm. O FCM espectral captura todas as emissões de fluorescence como espectros em um de 32 canais matriz PMT linear (PMT 32CH) para 500 nm a 800 nm e 2 PMT independentes para 420 nm a 440 nm e 450 nm a 469 nm, respectivamente, que substituem os filtros passa-banda convencionais. Os 488 e os pontos de laser 405/638 nm são espacialmente separadas, enquanto que os pontos de laser 405 nm e 638 nm são co-linear. Para cada partícula individual, as medidas espectrais FCM até 66 canais de dados de fluorescência são excitadas pela 405 nm e 488 nm lasers. Quando as células são excitados pelo laser de 638 nm, a FCM espectral mede 58 canais de dados de fluorescência por uma máscara é inserida para impedir que o laser de 638 nm a partir de brilho no PMT. Espectral FCM analisa os dados de espectro completo adquiridos com um algoritmo baseado no método dos mínimos quadrados ponderada (WLSM), que permite a separação de sobreposição de espectros de fluorescência. Os espectros derivada a partir de amostras individuais coradas e não coradas são reconhecidos como os espectros de referência de base. multi-amostras manchadas são matematicamente montado umnd não misturados, e o espectro de uma amostra com marcadores fluorescentes mistos é decomposto em um conjunto de seus espectros de constituinte. A desmistura, em tecnologia espectral 3, 4, substitui a compensação que remove o sinal de todos os detectores, excepto a uma medição de uma dada corante.
Neste estudo, foram combinados e testados 19 fluorocromos em uma única, a análise de 21 parâmetro que caracteriza os principais subconjuntos hematopoiéticas encontrados no baço de ratinho. Além disso, demonstramos que a citometria espectral pode gerenciar sinal de auto-fluorescente, melhorando, assim, a caracterização de linfócitos intra-epiteliais do intestino e do coração embrionário. Na verdade, nestes tecidos, gerenciamento auto-fluorescência permitiu a atribuição de fluorescência específica para as células que seriam excluídos da análise no FCM convencional.
Protocol
Representative Results
Discussion
FCM convencional baseia-se na detecção de fotões emitidos após a excitação de sondas fluorescentes. A emissão de fluorescência de um fluorocromo detectada num detector concebido para medir o sinal de outro fluorocromo induz sobreposição física. Este transbordamento entre os espectros de emissão precisa ser corrigido por compensações.
FCM espectral e o processamento de dados pelo algoritmo de desmistura desconvolução permite a combinação de fluorocromos com picos de emissão…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos as contribuições técnicas e teóricas em citometria espectral K. Futamura, que também revisou criticamente o manuscrito. Nós também estamos em dívida com C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, e P. Pereira pela leitura crítica do manuscrito e para aconselhamento técnico interminável e apoio. Agradecemos também P. Pereira pelo dom dos anticorpos marcados anti Vγ7-APC e Vδ4-biotina. Nós aknowledge do Centro d'Enseignements do Instituto Pasteur de boas-vindas e apoiar a logística de filmagem. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); Science Foundation e Pasteur Bourse Roux (SS) Swiss National; Fundação para a Ciência e Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); e Université Paris Diderot, a Agence Nationale de la Recherche (ANR) projeto Twothyme, a ANR, e Programa REVIVE (investimento para o futuro) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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