Анализ Суспензии клеток, выделенная из твердых тканей с помощью спектральной проточной цитометрии
Summary
В этой статье описана спектральные цитометрии, новый подход в проточной цитометрии, который использует форму спектров излучения, чтобы отличить флуорохромы. Алгоритм заменяет возмещения и может относиться к автофлуоресценции как независимый параметр. Этот новый подход позволяет для правильного анализа клеток, выделенных из солидных органов.
Abstract
Проточная цитометрия была использована в течение последних 40 лет для определения и анализа фенотипа лимфоидных и других гемопоэтических клеток. Первоначально ограниченный анализом нескольких флуорохромов, в настоящее время существуют десятки различных флуоресцентных красителей, и одновременно можно комбинировать до 14-18 различных красителей. Однако некоторые ограничения все еще ухудшают аналитические возможности. Из-за большого количества флуоресцентных зондов анализ данных становится все более сложным из-за необходимости больших многопараметрических матриц компенсации. Кроме того, появились модели мутантных мышей, несущих флуоресцентные белки для обнаружения и отслеживания конкретных типов клеток в разных тканях, поэтому необходим анализ (с помощью проточной цитометрии) суспензий автофлуоресцентных клеток, полученных из твердых органов. Спектральная проточная цитометрия, которая различает формы спектров излучения в широком диапазоне непрерывных длин волн, решает некоторые из этих проблем. Данные анализируются wIth алгоритма, который заменяет матрицу компенсации и обрабатывает автофлуоресценцию как независимый параметр. Таким образом, спектральная цитометрии потока должна быть способна различать флуорохромы с аналогичными пиками излучения и может обеспечить мульти-параметрический анализ без требований компенсации.
Этот протокол описывает спектральный анализ проточной цитометрии, что позволяет в течение 21-параметра (19) флуоресцентные зондов характеристики и управления авто-флуоресцентный сигнала, обеспечивая высокое разрешение в незначительном обнаружении населения. Результаты, представленные здесь, показывают, что спектральная проточной цитометрии представляет преимущества при анализе клеточных популяций из тканей трудно охарактеризовать в обычной проточной цитометрии, таких как сердце и кишечник. Спектральный проточной цитометрии, таким образом, демонстрирует мульти-параметрический аналитического потенциала высокопроизводительной обычной проточной цитометрии без требования о компенсации и дает возможность управления авто-флуоресценции,
Introduction
В течение последних нескольких десятилетий, проточной цитометрии (FCM) стал широко доступен аналитический метод необходим для изучения клеток фенотипирования. Там было значительное увеличение доступных флуоресцентных красителей, в частности , флюорохромами возбуждаются фиолетового лазера (405 нм) (например, Brilliant Violet и новые Q-точка красителей). Тем не менее, рост доступных флуоресцентных красителей повышает риск перекрывающихся выбросов и требует матрицы компенсации трудоемкой. FCM стал широко использоваться для анализа клеточных суспензий из твердых тканей, но наличие авто-флуоресцентного клеток ограничивает дискриминацию специально обозначенных групп населения.
Основные принципы спектрального FCM представлены подробно в Futamura и соавт. 1, 2. Если коротко, то спектральная ТСМ используется здесь (смотри таблицу материалов) оснащена 405, 488 и 638 нм лазеров. Спектральная ТСМ фиксирует весь испускаемый пluorescence в спектрах в 32-канальный линейный массив РМТ (ПМТ) 32ch на длине волны 500 нм до 800 нм и 2 независимых ФЭУ для 420 нм до 440 нм и 450 нм до 469 нм, соответственно, которые заменяют обычные фильтры полосовые. 488 и лазерные пятна 405/638 нм пространственно разделены, в то время как 405 нм и 638 нм лазерные пятна коллинеарной. Для каждой отдельной частицы, спектральные меры FCM до 66 каналов данных флуоресценции при возбуждении на 405 нм и 488 нм лазеров. Когда клетки возбуждаются нм лазера 638, спектральная ТСМ измеряет 58 каналов данных флуоресценции, так как маска вставлена, чтобы предотвратить 638 нм лазер светит в ПМТ. Спектральный анализ ТСМ полученные полные данные спектра с помощью алгоритма на основе метода взвешенной по методу наименьших квадратов (WLSM), что дает возможность разделения перекрывающихся спектров флуоресцентного. Спектры получены из отдельных окрашенных и неокрашенных образцов признаны в качестве основных эталонных спектров. Мульти-окрашенные образцы математически, подключеный несмешанные, и спектр образца со смешанными флуоресцентными метками разлагаются в совокупность ее состав спектров. Несмешивание, в спектральной технологии 3, 4, заменяет компенсацию , который удаляет сигнал от всех датчиков , кроме одного измерения данного красителя.
В этом исследовании мы объединили и проходят 19 флуорохромов в одном, 21-анализа параметров, которые были характерны основные кроветворные подмножества найдены в селезенке мыши. Кроме того, мы показали, что спектральная цитометрии может управлять авто-флуоресцентный сигнал, тем самым улучшая характеристику кишечника внутри эпителиальных лимфоцитов и эмбрионального сердца. Действительно, в этих тканях, управление автофлуоресценцией позволило для назначения специфической флуоресценции клеток, которые будут исключены из анализа в обычном ТСМЕ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обычный ТСМ основан на обнаружении фотонов, излученных после возбуждения флуоресцентных зондов. Излучения флуоресценции одного флуорохрома обнаруженного в детекторе, предназначенный для измерения сигнала от другого флуорохрома вызывает физическое перекрытие. Это перелив среди спе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем технический и теоретический вклад в спектральную цитометрию К. Футамуры, который также критически пересмотрел рукопись. Мы также признательны К. Айт-Мансуру, П.-Х. Commere, A. Bandeira и P. Pereira за критическое чтение рукописи и бесконечные технические консультации и поддержку. Мы также благодарим П. Перейру за дар анти-Vγ7-APC и антител, меченных Vδ4-биотином. Мы знаем Центр d'Enseignements от института Пастера для того, чтобы приветствовать и поддерживать логистику съемок. Эта работа была поддержана Институтом Пастера, Национальным институтом прикладной математики (INSERM); Швейцарский национальный научный фонд и Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciêccia ea Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); И Université Paris Diderot, проект Национального агентства по реформе (ANR) Twothyme, ANR и программа REVIVE («Инвестиции в будущее»)) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. “String theory” of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
