Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo
Summary
Este artículo describe espectral citometría, un nuevo enfoque en la citometría de flujo que utiliza las formas de los espectros de emisión para distinguir fluorocromos. Un algoritmo reemplaza compensaciones y puede tratar autofluorescencia como un parámetro independiente. Este nuevo enfoque permite el análisis adecuado de células aisladas de órganos sólidos.
Abstract
La citometría de flujo se ha utilizado durante los últimos 40 años para definir y analizar el fenotipo de linfoide y otras células hematopoyéticas. Inicialmente restringida al análisis de unos fluorocromos, actualmente hay de diferentes colorantes fluorescentes decenas, y hasta 14-18 colorantes diferentes se pueden combinar a la vez. Sin embargo, varias limitaciones todavía en menoscabo de las capacidades analíticas. Debido a la multiplicidad de sondas fluorescentes, análisis de datos se ha vuelto cada vez más compleja debido a la necesidad de matrices, de compensación multi-paramétricos grandes. Además, los modelos de ratones mutantes que llevan las proteínas fluorescentes para detectar y rastrear tipos específicos de células en diferentes tejidos han estén disponibles, así se requiere el análisis (por citometría de flujo) de las suspensiones celulares de auto-fluorescente obtenidos a partir de órganos sólidos. Espectral citometría de flujo, que distingue las formas de los espectros de emisión a lo largo de una amplia gama de longitudes de onda continuas, aborda algunos de estos problemas. Los datos se analizan wITH un algoritmo que reemplaza matrices de compensación y trata la auto-fluorescencia como un parámetro independiente. Por lo tanto, espectral citometría de flujo debe ser capaz de discriminar fluorocromos con picos de emisión similares y puede proporcionar un análisis multi-paramétrico sin requisitos de compensación.
Este protocolo describe el flujo espectral citometría de análisis, lo que permite un parámetro 21 (19 sondas fluorescentes) caracterización y la gestión de una señal de auto-fluorescente, proporcionando alta resolución en la detección de la población menor. Los resultados presentados aquí muestran que el flujo espectral presenta citometría de ventajas en el análisis de las poblaciones de células a partir de tejidos difíciles de caracterizar en citometría de flujo convencional, tales como el corazón y el intestino. Espectral citometría de flujo por lo tanto demuestra la capacidad de análisis multi-paramétrico de gestión de alto rendimiento citometría de flujo convencional sin el requisito para la compensación y permite auto-fluorescencia.
Introduction
En las últimas décadas, la citometría de flujo (FCM) se convirtió en un método analítico ampliamente disponible esencial para los estudios de fenotipo celular. Ha habido un aumento sustancial en los colorantes fluorescentes disponibles, particularmente fluorocromos excitada por el láser violeta (405 nm) (por ejemplo, violeta brillante y nuevos colorantes Q-punto). Sin embargo, el crecimiento de colorantes fluorescentes disponibles aumenta el riesgo de emisiones superpuestas y requiere matrices de compensación de trabajo intensivo. FCM se hizo ampliamente utilizados para analizar las suspensiones de células a partir de tejido sólido, pero la presencia de células de auto-fluorescente limita la discriminación de las poblaciones marcadas específicamente.
Los principios básicos de la FCM espectral se presentan en detalle en Futamura et al. 1, 2. Brevemente, el FCM espectral utilizado aquí (ver la tabla de materiales) está equipado con 405, 488, y 638 láseres nm. El FCM espectral captura toda la f emitidaluorescence como espectros en un 32-canal de matriz lineal PMT (PMT 32ch) para 500 nm a 800 nm y 2 PMTs independientes para 420 nm a 440 nm y 450 nm a 469 nm, respectivamente, que sustituyen a los filtros de paso de banda convencionales. Los y los puntos de láser 488 405/638 nm están espacialmente separados, mientras que los puntos de láser 405 nm y 638 nm son co-lineal. Para cada partícula individual, las medidas espectrales FCM hasta 66 canales de datos de fluorescencia excitadas por la 405 nm y 488 nm láser. Cuando las células son excitados por el láser 638 nm, la espectral FCM mide 58 canales de datos de fluorescencia debido a una máscara se inserta para evitar que el láser 638 nm penetren en el PMT. Espectral FCM analiza los datos de espectro completo adquiridos con un algoritmo basado en el método de mínimos cuadrados ponderada (WLSM), que permite la separación de la superposición de los espectros de fluorescencia. Spectra derivadas de muestras de un solo teñidas y no teñidas son reconocidos como los espectros de referencia básica. muestras de múltiples manchas son matemáticamente dotados de unand sin mezclar, y el espectro de una muestra con marcadores fluorescentes mixtos se descompone en una colección de sus espectros de constituyente. La desmezcla, en la tecnología espectral 3, 4, sustituyendo la compensación que elimina la señal de todos los detectores excepto la medición de un colorante dado.
En este estudio, se combinaron y probamos 19 fluorocromos en una sola 21-parámetro de análisis, que caracteriza las principales subconjuntos hematopoyéticas se encuentran en el bazo de ratón. Además, hemos demostrado que la citometría espectral puede gestionar señal de auto-fluorescente, mejorando así la caracterización de linfocitos intra-epiteliales intestinales y del corazón embrionario. De hecho, en estos tejidos, la gestión de auto-fluorescencia permitió la asignación de la fluorescencia específica de las células que se excluyó del análisis en FCM convencional.
Protocol
Representative Results
Discussion
FCM convencional se basa en la detección de fotones emitidos después de la excitación de las sondas fluorescentes. La emisión de fluorescencia de uno fluorocromo detectado en un detector diseñado para medir la señal de otro fluorocromo induce solapamiento físico. Este desbordamiento entre los espectros de emisión debe ser corregido por compensaciones.
FCM espectral y de procesamiento de datos por el algoritmo de desmezcla deconvolución permite la combinación de fluorocromos con pic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos las contribuciones técnicas y teóricas en citometría espectral de K. Futamura, que también revisión crítica del manuscrito. También estamos en deuda con C-Ait Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, y P. Pereira para la lectura crítica del manuscrito y de asesoramiento técnico y el apoyo sin fin. Agradecemos también a P. Pereira por el don de las Vγ7-APC y Vδ4-Biotina anticuerpos anti etiquetados. Nos aknowledge el Centre d'Enseignements del Instituto Pasteur de la acogida y el apoyo a la logística de filmación. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); la Fundación Ciencia y Pasteur Bolsa Roux (SS) Nacional de Suiza; Fundação para a Ciência ea Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); y la Université Paris Diderot, la Agencia Nacional de la Investigación (ANR) Twothyme proyecto, la ANR, y el Programa REVIVE (Inversión para el Futuro) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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