Enkel homogenisering blev anvendt til at fremstille nye, højdensitets-, lipoproteinlignende nanopartikler til indkapsling af nervevækstfaktor. Udfordringer, detaljerede protokoller til fremstilling af nanopartikler, in vitro karakterisering og in vivo undersøgelser er beskrevet i denne artikel.
Formålet med denne artikel er at indføre præparations- og karakteriseringsmetoder til nervevækstfaktor (NGF) -belastede, højdensitets-, lipoprotein (HDL) -imiterende nanopartikler (NP'er). HDL'er er endogene NP'er og er blevet udforsket som vehikler til levering af terapeutiske midler. Forskellige fremgangsmåder er blevet udviklet til fremstilling af HDL-imiterende NP'er. Men de er generelt komplicerede, tidskrævende og vanskelige til industriel opskalering. I dette studie blev en-trin-homogenisering brugt til at blande excipienserne og danne prototypen NP'er. NGF er et vandopløseligt protein på 26 kDa. For at lette indkapslingen af NGF i lipidmiljøet af HDL-imiterende NP'er blev protamin USP brugt til at danne et ion-par-kompleks med NGF for at neutralisere ladningerne på NGF-overfladen. NGF / protaminkomplekset blev derefter indført i prototypen NP'er. Apolipoprotein Al blev endelig overtrukket på overfladen af NP'erne. NGF HDL-imiterende NP'er viste foretrukne egenskaber i termenS med partikelstørrelse, størrelsesfordeling, indfangningseffektivitet, in vitro frigivelse, bioaktivitet og biodistribution. Med det omhyggelige design og udforskning af homogenisering i HDL-imiterende NP'er blev proceduren forenklet, og NP'erne blev gjort skalerbar. Desuden blev forskellige udfordringer, som f.eks. Adskillelse af losset NGF fra NP'erne, gennemført pålidelige in vitro frigivelsesundersøgelser og måling af NP'ernes bioaktivitet, overvundet.
Macromolekyler, såsom proteiner, peptider og nukleinsyrer, er kommet frem som lovende medicin og har fået stor opmærksomhed i de sidste årtier 1 , 2 . På grund af deres høje effektivitet og specifikke handlingstilstande udviser de et stort terapeutisk potentiale til behandling af cancer, immunforsvar, hiv og relaterede tilstande 3 , 4 . Imidlertid gør fysisk-kemiske egenskaber, såsom deres store molekylære størrelse, tredimensionelle struktur, overfladeafgifter og hydrofil natur, in vivo- afgivelsen af disse makromolekyler meget udfordrende. Dette hæmmer væsentligt deres kliniske anvendelse 4 . Nylige fremskridt inden for lægemiddelleveringssystemer, såsom mikropartikler, polymer nanopartikler (NP'er), liposomer og lipid-NP'er, overvandt disse udfordringer og forbedrede signifikant in vivo- afgivelsen af makromolekyler. HoWever, nogle ulemper med hensyn til disse leveringsgoder er blevet afsløret, herunder lav lægemiddelbelastningskapacitet, lav indfangningseffektivitet, kort halveringstid, tab af bioaktivitet og uønskede bivirkninger 5 , 6 , 7 , 8 . Effektive bæresystemer forbliver et område af forskningsinteresse. Desuden er udviklingen af analytiske metoder til karakterisering af narkotikaindlæste NP'er mere udfordrende for makromolekyler end for små molekyler.
High-density lipoprotein (HDL) er en naturlig NP sammensat af en lipidkerne, der er overtrukket af apolipoproteiner og et phospholipidmonolag. Endogen HDL spiller en kritisk rolle i transporten af lipider, proteiner og nukleinsyrer gennem dets interaktion med målreceptorer, såsom SR-BI, ABCAI og ABCG1. Det er blevet udforsket som et middel til levering af forskellige terapeutiske midler 9, 10 , 11 , 12 . Forskellige fremgangsmåder er blevet udviklet til fremstilling af HDL-imiterende NP'er. Dialyse er en populær tilgang. Ved denne fremgangsmåde dannes NP'er ved at hydrere en lipidfilm under anvendelse af natriumcholatopløsning. Saltet fjernes derefter gennem en 2 dages dialyse med tre buffere 13 . Sonikationsmetoder fremstiller NP'er ved at sonicere en lipidblanding i 60 minutter under en opvarmningstilstand; NP'erne renses yderligere ved hjælp af gelkromatografi 14 . Mikrofluidika genererer NP'er via en mikrofluidisk enhed, der blander phospholipider og apolipoprotein AI (Apo AI) -opløsninger ved at skabe mikrovortice i et fokuseringsmønster 15 . Disse metoder kan tydeligvis være tidskrævende, hårde og vanskelige til industriel opskalering.
I denne artikel introducerer vi forberedelsen og karakteriseringen af nye HDL-imiterende NP'er til nerveVækstfaktor (NGF) indkapsling. NGF er en disulfidbundet polypeptid-homodimer indeholdende to 13,6-kDa polypeptidmonomerer. En ny fremgangsmåde til fremstilling af NP'erne ved homogenisering efterfulgt af indkapslingen af NGF i NP'erne blev udviklet. De NGF HDL-imiterende NP'er blev karakteriseret for partikelstørrelse, størrelsesfordeling, zeta potentiale og in vitro frigivelse. Deres bioaktivitet blev evalueret for neuritudvækst i PC12-celler. Biodistributionen af NGF HDL-imiterende NP'er blev sammenlignet med den for fri NGF efter intravenøs injektion i mus.
I denne undersøgelse demonstrerer vi en simpel metode til at forberede HDL-imiterende NP'er til NGF-indkapsling. Forskellige NP-leveringssystemer er blevet undersøgt for at levere proteiner. I øjeblikket involverer mange NP-præparater dialyse, opløsningsmiddelfældning og filmhydratisering. Disse processer er generelt komplicerede og udfordrende ved opskalering. Under denne NP-udvikling blev det bestemt, at lipiderne havde stærk adhæsion til beholderens glasvæg, hvilket førte til vanskelighederne ved hydrat…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev understøttet af NIH R03 NS087322-01 til Dong, X.
Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
L-a-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1mg in 671 µl 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |