Method Article

신경 성장 인자 인 캡슐 레이션을위한 새로운 HDL 모방 나노 입자의 제조 및 특성 규명

DOI:

10.3791/55584

⸱

May 22nd, 2017

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

간단한 균질화를 사용하여 신경 성장 인자를 캡슐화하기위한 고밀도의 고밀도 지단백질 모방 나노 입자를 제조 하였다. 과제, nanoparticle 준비, 시험관 특성 및 생체 내 연구에 대한 자세한 프로토콜은이 문서에서 설명합니다.

Abstract

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이 기사의 목적은 신경 성장 인자 (NGF) - 부하 된 고밀도 지단백질 (HDL) - 흉내내는 나노 입자 (NP)에 대한 준비 및 특성화 방법을 소개하는 것입니다. HDL은 내인성 NP이며 치료제를 전달하기위한 수단으로 사용됩니다. HDL 모방 NP를 제조하기위한 다양한 방법이 개발되었다. 그러나, 이들은 일반적으로 복잡하고, 시간 소모적이며, 산업적 규모면에서 어렵다. 이 연구에서는 1 단계 균질화를 사용하여 부형제를 혼합하고 원형 NP를 형성했습니다. NGF는 26 kDa의 수용성 단백질이다. HDL 모방 NP의 지질 환경으로의 NGF 캡슐화를 촉진하기 위해 프로타민 USP를 사용하여 NGF와 이온 쌍을 형성시켜 NGF 표면의 전하를 중화시켰다. NGF / 프로타민 복합체는 원형 NP에 도입되었다. 최종적으로 Apolipoprotein AI가 NP의 표면에 코팅되었다. NGF HDL 모방 NP는 장기간에 바람직한 특성을 보였다입자 크기, 크기 분포, 포착 효율, 생체 외 방출, 생체 활성 및 생체 분포에 관한 정보를 제공합니다. HDL 모방 NP의 조심스럽게 설계 및 균질화를 통해 절차가 크게 단순화되었으며 NP는 확장 성을 갖게되었습니다. 더욱이, NP로부터 무부하 NGF를 분리하고, 신뢰할 수 있는 시험 관내 방출 연구를 수행하고, NP 의 생체 활성을 측정하는 것과 같은 다양한 과제가 극복되었다.

Introduction

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단백질, 펩타이드 및 핵산과 같은 거대 분자는 유망한 약물로 등장하여 지난 수십 년 동안 상당한 주목을 받았다. 높은 효능과 특수한 행동 방식으로 인해 암, 면역 질환, HIV 및 관련 질병 치료에 큰 치료 잠재력을 나타냅니다 3 , 4 . 그러나, 큰 분자 크기, 3 차원 구조, 표면 전하 및 친수성과 같은 물리 화학적 성질은 이러한 거대 분자의 생체 내 전달을 매우 어렵게 만든다. 이것은 그들의 임상 적 사용을 상당히 방해한다. 미립자, 고분자 나노 입자 (NP), 리포좀 및 지질 NP와 같은 약물 전달 시스템의 최근 발전은 이러한 과제를 극복하고 고분자 의 생체 내 전달을 크게 향상시켰다. 호경미한 로딩 용량, 낮은 포착 효율, 짧은 반감기, 생체 활성 상실 및 바람직하지 못한 부작용 5 , 6 , 7 , 8을 포함 하여 이러한 운반화물에 관한 몇 가지 단점이 밝혀졌습니다. 효과적인 운송 시스템은 여전히 ​​연구 관심 분야....

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Protocol

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참고 : 모든 절차에 포함 된 동물 연구는 노스 텍사스 보건 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. NGF HDL을 모방 한 나노 입자의 제조

  1. 부형제 인 포스파티딜콜린 (PC), 스 핑고 미엘린 (SM), 포스파티딜 세린 (PS), 콜레 스테 릴 올레 에이트 (CO) 및 D-α- 토코 페릴 폴리에틸렌 글리콜 석시 네이트 (TPGS)를 에탄올에 용해시켜 1 mg / mL의 원액을 제조하십시오.
    참고 : 저장 용액을 나누어서 -20 ° C에 보관하십시오. 콜레스테롤 올레 에이트는 어두운 병에 보관되었습니다. PC, SM, PS 및 CO 저장 용액은 -20 ℃에서 각각 6, 3, 12, 12 개월 동안 안정했다. TPGS 용액은 -20 ℃에서 12 개월 이상 안정했다.
  2. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 프로타민 USP (물에 1 MG / ML) 10 μL와 NGF (물에 1 MG / ML) 10 μL를 섞어서 실온에서 10 분 동안 서게하십시오복합체를 형성합니다.
    참고 : NGF와 프로타민 원액을 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오. 반복되는 동결 및 해동은 NGF 주식에는 권장되지 않습니다.
  3. 유리 병에 PC 59 μL, SM 11 μL, PS 4 μL....

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Results

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이온 쌍 전략에 의해 준비된 HDL 모방, α- 토코페롤 코팅 NGF NP의 엔지니어링 계획이 그림 1 에 나와 있습니다. NGF의 표면 전하를 중화시키기 위해, 프로타민 USP를 이온 쌍 제제로 사용하여 NGF와 복합체를 형성시켰다. 생체 활성을 보호하기 위해 프로토 타입 HDL 모방 NP를 먼저 균질화를 사용하여 조작했습니다. 그 다음, NGF / 프로타민 복합체가 원형 NP로 캡슐화되었다. 균질화는 충분한 에너지를 제공하고 성공적으로 부형제의 혼합을 촉진시켰다. 3 분 균질화 후, 프로토 타입 NP에 대해 일정한 입자 크기 (약 170 nm)가 얻어졌다 ( 그림 2 ). Apo AI를 실온에서 2 시간 동안 교반하는 것을 포함하여 상이한 조건에서 원형 NP와 함께 인큐베이션 하였다; 실온에서 4 시간 교반; 4 시간 동안 실온에서 교반 한 후, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하.......

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Discussion

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이 연구에서는 NGF 캡슐화를 위해 HDL 모방 NP를 준비하는 간단한 방법을 시연합니다. 다양한 NP 전달 시스템이 단백질을 전달하기 위해 연구되었습니다. 현재 많은 NP 준비 과정에는 투석, 용매 침전 및 필름 수화가 포함됩니다. 이러한 프로세스는 일반적으로 규모가 커질 경우 복잡하고 까다로운 작업입니다. 이 NP 발달 동안, 지질은 용기의 유리 벽에 강한 접착력을 가지므로 박막을 수화하고 부형제를 효율적으로 혼합하는 것이 어려웠다. 천연 HDL NP의 여러 구성 요소를 고려할 때, 혼합은 HDL 모방 NP의 준비에 매우 어려워지고 결정적으로되었습니다. 결과에 따르면, 온도와 혼합 시간을 증가시키는 것은 NP 형성을 돕지 못했다. 호 모지 나이저는 산업 생산에서 일반적인 도구이며 혼합에 높은 에너지와 전단력을 제공합니다. 이 장비를 NP 제제에 적용하여 단 분산 NP를적절한 크기가 3 분 내에 생산되었으며 ( 그림 2 및 그림 3 ), 이는 제조 시간을 크게 줄이.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 연구는 Dong, X.에 NIH R03 NS087322-01에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
재조합 인간 베타 -NGF크리에이티브 바이오 마트NGF-05H
L-&알파;-포스파티딜콜린(PC)Avanti131601P95%, 계란, 닭
스핑고미엘린(SM)Avanti860062P뇌, 돼지
포스파티딜세린(PS)Avanti840032P뇌, 돼지
콜레스테릴 올레이트(CO)시그마C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)BASF9002-96-4비타민 E 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이
Protamine sulfateSigmaP3369USP 테스트 사양을 충족합니다
Apolipoprotein A1, Human plasmaAthens Research & 기술16-16-120101671 µ에 1 mg; L 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CLSigmaCL4B200Cross-linked agarose,  겔 여과 크로마토그래피 컬럼 충전재
샌드위치 ELISA Kit for NGFR& D 시스템DY008
소 혈청 알부민시그마A2153
RPMI-1640 매체GE 헬스케어 생명 과학SH30096.02
말 혈청GE 헬스케어 생명 과학SH30074.03
소 태아 혈청Gibco10082147
PC12 세포ATCCCRL-1721
쥐 꼬리 콜라겐 유형 I시그마C3867
아세트산 나트륨시그마S2889
염화나트륨시그마31414
트리톤 X-100시그마T8787
페닐 메탄 설포닐 플루오 라이드 (PMSF)시그마P7626
벤제 토늄 클로라이드시그마B8879
이름 < / strong> 회사 < / strong>카탈로그 번호 코멘트 < / strong>
Equipment< / strong>
HomogenizerTekmarT 25-S1
Delsa Nano HC 입자 분석기Beckman-CoulterDelsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 투석 장치스펙트럼 실험실G235036Molecule Cutoff 300 kDa
원심분리기Eppendoff5424R
Polytron homogenizerKinematicaPT 1200C
DecapiCone  브레인트리 사이언티픽 Inc.직류 - M200
트 는 .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
  2. Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. ....

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