ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました
Summary
ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。
Abstract
プログラマブル・ゲノム・編集ツールの開発は、特定のゲノム配列は、細胞および生物全体の機能に果たす役割を理解するための逆遺伝学の使用を容易にしました。この原因は、途方もなくCRISPR / Cas9システム – 研究者が対象で、他のもののうち、ノックアウト、するために、ゲノムやトランスクリプトームを操作ノックダウン、または遺伝子にノックすることを可能にする汎用性の高いツールの最近の導入によって助けられています方法。遺伝子をノックアウトするために、CRISPR / Cas9媒介二本鎖切断は、切れ目サイトでのヌクレオチドのフレームシフトの原因挿入または欠失を導入する非相同末端結合DNA修復経路を募集します。しかし、個々のガイドRNAは、望ましくないオフターゲット効果を引き起こす可能性があり、これらを除外するために、複数のガイドRNAの使用が必要です。ターゲットのこの多様性はまた、今度はEFの使用を頼むれ、クローンの大量スクリーニングが必要であることを意味しノックアウトクローンの遺伝子型を決定するために、ハイスループット技術をficient。現在のジェノタイピング技術のいずれかは、それゆえ、高スループットのために、彼らは不適当、固有の限界に苦しむやコスト高を招きます。ここでは、詳細テンプレートとして粗細胞溶解物からのゲノムDNAを使用する蛍光PCRを用いて、次いで、キャピラリーゲル電気泳動によりPCRフラグメントを解決するためのプロトコル。この技術は、断片間に1つの塩基対の違いを区別するのに十分に正確であり、従って、標的遺伝子のコード配列におけるフレームシフトの有無を示すに十分です。この正確な知識を効果的に確認シーケンシング工程の必要性を排除し、ユーザーがプロセスに時間とコストを節約することができます。また、この技術は、ここで他の場所に示すように、多数の遺伝子に対するガイドRNAによって標的様々な組織起源の種々の哺乳動物細胞を遺伝子型決定に汎用性であることが証明されました。
Introduction
逆遺伝的アプローチは、科学者たちは、細胞または生物全体のゲノム中の特定の変化の影響を解明することができました。例えば、特定の遺伝子の発現は、これは、細胞の又は上の機能に及ぼす影響を決定するために、遺伝子ノックダウン1、2（部分的還元）または遺伝子ノックアウト3、4（完全切除）によって減衰させることができます生物の発生。
遺伝子ノックアウト実験は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）などの配列特異的プログラマブルヌクレアーゼ、の導入以来、より簡単になってきました。しかし、定期的にクラスタ化されたのは比較的最近の特徴付けは短い回文構造の繰り返し（CRISPR）を散在/ Cas9システムは、世代を実行するために、世界中のすべての実験室のためのそれは非常に簡単になりましたEノックアウト実験。本質的に、CRISPR / Cas9システムは、2つの必須成分、認識し、ゲノム中の特定の配列、及びCas9呼ばれるエンドヌクレアーゼに塩基相補性を介して結合する単一ガイドRNA（sgRNA）、から成ります。ゲノムDNA上のsgRNA-Cas9複合体の特異的結合および作用の余波は、DNAの二本鎖切断です。これは、今度は、その後の非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え（HR）経路を介して修復される細胞内のDNA損傷応答機構をトリガします。 NHEJ修復メカニズム（ただしHRメカニズム）は、多くの場合、挿入/欠失（インデル）の変異が生じ、修理の現場でのヌクレオチドのランダムな挿入または削除になりますので、それがシフトするエクソンの読み枠を引き起こす可能性があります。これは、その後、翻訳とナンセンス媒介崩壊5、6の早期終了に伴う遺伝子のノックアウトをもたらすことができます7。
遺伝子ノックアウトにCRISPR / Cas9システムの導入によって得られる利便性にもかかわらず、標的細胞のクローンの遺伝子型決定は、特に、8、9の設定ハイスループットで、ボトルネックのままです。主要な固有の制限を受けるか、財政的に高価であり、いずれかの既存の技術。これらのクローンは同一の対立遺伝子を有しているので、例えば、10の二重鎖DNA中のミスマッチを検出する酵素アッセイでSURVEYORまたはT7E1アッセイは、野生型クローンおよびホモ接合変異体（対立遺伝子同一に変異させるクローン）を区別することができないので、彼らのDNA配列11に不整合が存在しません。また、高スループットの設定で、変異体クローンの遺伝子型決定におけるゴールドスタンダードと考えられているサンガー法の使用は、その高いコストのために望ましくありません。ここでは、DETを提示します他の既存の遺伝子型決定技術の制限を回避し、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループットスクリーニングを実施するのに特に有用であることができ、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法、のailedプロトコル。このメソッドは、実行することが技術的に簡単で、時間とコストを節約できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
選択のモデル細胞株に特異的な遺伝子のノックアウト遺伝子が特定の細胞のコンテキストで果たす役割を解明するためのルーチンとなっています。実際には、いくつかのゲノムワイドスクリーンはゲノム14、15、16に実質的に全ての公知のヒト遺伝子を標的とするためにCRISPR / Cas9システムを使用する現在利用可能です。こ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、キャピラリーゲル電気泳動実験を助けるため女史タン市ミンさん、ヘレン・オング、博士ザオ・イ感謝したいと思います。この作業は、/ 2011分の1314 NMRCとMOE ACRFティア2基金助成金MOE2011-T2-1-051を付与NMRC / IRGによってサポートされていました。
Materials
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
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