ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト卵黄扁平上皮癌試料におけるT細胞亜集団の四色蛍光免疫組織化学
Summary
多パラメータ蛍光免疫組織化学を用いて、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の数、相対分布、および局在を評価することができる。この文献は、口腔咽頭癌におけるT細胞亜集団を分析するためのこの技術の使用を記載している。
Abstract
4色蛍光免疫組織化学（IHC）技術は、それらの相対的分布および組織におけるそれらの局在を考慮に入れながら、目的の細胞集団を定量する方法である。この技術は、様々な腫瘍型の免疫浸潤を研究するために広く適用されている。腫瘍微小環境は、腫瘍部位に引き付けられる免疫細胞によって浸潤される。異なる免疫細胞集団は、腫瘍微小環境において異なる役割を果たすこと、および疾患の転帰に異なる影響を有することが見出されている。この原稿では、口腔咽頭扁平上皮癌（OPSCC）上の多パラメータ蛍光IHCの使用を例として説明します。この技術は、他の組織サンプルおよび目的の細胞型に拡張することができる。提示された研究では、大きなOPSCCコホート（n = 162）の上皮内および間質コンパートメントを分析した。我々は、全Tリンパ球（CD3 + ）、免疫抑制性調節間質から腫瘍上皮を区別するために核対比染色を用いて、T細胞（Tregs; すなわち FoxP3 + ）およびTヘルパー17（Th17）細胞（ すなわち、 IL-17 + CD3 +腫瘍内IL-17 +非T細胞の数が少ない患者において、多数のT細胞が無病生存期間の改善と相関することが見出された。これは、IL-17 +非T細胞がOPSCCにおける貧弱な免疫応答と相関し得ることを示唆し、これはIL-17と癌患者における生存率の間の相関と一致する。現在、7つまでの異なる蛍光色素を用いて新規なマルチパラメータ蛍光IHC技術が開発されており、腫瘍微小環境における免疫細胞のより正確な特徴付けおよび局在化が可能になる。
Introduction
口腔咽頭扁平上皮癌（OPSCC）は、口腔咽頭に由来する扁平上皮細胞癌の異種群である。 OPSCCの危険因子は、ヒトパピローマウイルス（HPV）感染症とアルコールとタバコの使用1、2が挙げられます。免疫反応の役割とこれを臨床現場でどのように使用するかは、まだ検討され始めています。腫瘍微小環境は、癌部位に引き付けられる免疫細胞によって浸潤される。 OPSCC患者3では、高いCD8 +細胞傷害性T細胞頻度が改善された生存と相関しているが、TregおよびTh17細胞を含む他のT細胞サブセットの役割は依然として不明である4 。 Th1およびTh17細胞は、腫瘍細胞を標的とする免疫応答を助長すると考えられているが、Tregsは、他のT細胞の活性を抑制する能力に関してよく知られている5 。しかしながら、Tregsは、異なる腫瘍のタイプ6における好都合な反応および好ましくない反応の両方と相関することが見出されている6 。血液中に存在する全ての免疫細胞が腫瘍に同程度まで浸潤するわけではないので、局所腫瘍微小環境を研究することは、腫瘍に対して指向される免疫応答の最も信頼できる尺度を提供する。この研究の目的は、免疫細胞の数とタイプと臨床結果との間の相関関係を決定することである。我々は、ヒトOPSCCにおける種々のT細胞亜集団の数および局在を分析するために、4色蛍光IHCイメージングを使用した。
我々は、分化経路がTh17細胞と密接に関連しているトータルTリンパ球（CD3 + ）、Th17細胞、および免疫抑制性FoxP3 + Tregsに焦点を当てた。 Th17細胞は、CD3とIL-17との組み合わせによって特徴付けられる。サイトカインIL-17はまた、非T細胞によって産生され得る7 。我々は、イントラ – エピトープの分布を決定したヘリカルおよび間質性T細胞、Tregs、Th17、およびIL-17 +非T細胞を、OPSCC症例の大規模シリーズで分析し、患者の生存との相関を分析した。多色蛍光IHCを使用して、CD3、Foxp3、およびIL-17の発現を、DAPI対比染色剤と組み合わせて同定した。このアッセイは、腫瘍細胞（DAPI核染色を使用）および浸潤T細胞集団（異なるマーカーの組み合わせを使用する）の両方の容易かつ明確な同定を可能にした。試料の調製および染色の後、蛍光顕微鏡および画像化ソフトウェアを使用して、使用される異なる蛍光色を分離し、腫瘍上皮および腫瘍関連間質の両方に存在する細胞の数および型を決定した。
免疫細胞集団を定量化および表現する別のアッセイは、フローサイトメトリー分析、または腫瘍または末梢サンプル（ すなわち血液または腹水）の飛行時間（CyTOF）分析によるサイトメトリーである。これを使用する異なる細胞型の局在化および相対的分布に関するすべての情報が失われる。末梢サンプルの使用および分析はまた、どの細胞が腫瘍微小環境に浸潤できるかについての情報を提供しない。血液および腹水免疫細胞の分析は、腫瘍組織8,9の免疫細胞浸潤の表現型および頻度を反映しないことが示されています。
もう一つの選択肢は、明視野顕微鏡の使用である。蛍光イメージングに対するこの技術の利点は、組織自己蛍光がないことである。いくつかの試料はより多くの自家蛍光、特に赤血球を含有するが、好中球顆粒球を含む他の細胞型も含まれるが、これらの領域はほとんどすべての試料の分析において容易に除去することができる。免疫蛍光法は、標的蛍光体のパネルを使用することにより、1つの試料中の複数のマーカーを分析する利点を提供するnt個の波長を有する。これは、特定の抗原についての十分な数の標識および市販の抗体アイソタイプの欠如のために、明視野顕微鏡法については現在同じ程度には不可能である。
ここで説明した多色蛍光IHC技術は、例えば、ヒト白血球抗原（HLA）とPD-L1 10、11などの異なる免疫細胞集団、ならびに腫瘍細胞発現分子を研究する癌の種類及び抗体の組合せさまざまに使用されています12 。このプロトコールは、多くの異なるタイプのサンプルおよび抗体を用いて確立され、検証されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されたプロトコールについて、最も重要な工程の1つは、使用される一次抗体の正確な希釈を決定することである。これらの特異的なAlexa標識抗体の製造元が推奨するように、標識二次抗体の希釈度は1：200であった。一次抗体の希釈は、好ましくは意図された組織型の2つの異なる試料（この場合はOPSCC）を用いて連続希釈によって決定されるべきである。最適な作業希釈は、バックグラウ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Simone Puntは、オランダ癌協会の助成金UL2010-4801の支援を受けました。我々は、このJoVEプロトコルが基づいている元の論文の共著者すべてに感謝したいと思います：Emilie A. Dronkers、Marij JP Welters、Renske Goedemans、SenadaKoljenović、Elisabeth Bloemena、Peter JF Snijders、Arko Gorter、Sjoerd vanバーグ。
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?. Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?. Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. . Essential Medical Statistics. , (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. . Survival Analysis: A Self-Learning Text. , (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
