Den exponerade normala okulära ytan består av hornhinna och konjunktiva. Epitelceller, bägge celler och immunceller är närvarande i konjunktiva. Här beskrivs en icke-invasiv teknik för intryckcytologi med användning av en intryckcytologianordning och flödescytometri för att analysera immunceller i konjunktiva.
Traditionellt studeras okular ytcytologi med tekniker som spatelteknik och borstteknik. Problemet med dessa tekniker är att de kan inducera traumatiska skador på ögans yta, vilket kan utvecklas till ärrbildning, ögonlocksdeformitet, brist på stamceller och i vissa fall orsaka stort obehag för patienten. För att undvika dessa kliniska problem utvecklades intryckcytologi (IC) för att diagnostisera torr ögonsjukdom och senare neoplasi, atopisk sjukdom, vernal keratokonjunktivit och keratoconjunctivitis sicca. Typiskt skär kliniker manuellt filterpapper i nödvändiga former och applicera dessa på okularytan. Här beskriver vi hur man utför IC med hjälp av en kommersiellt tillgänglig medicinsk enhet. Denna teknik förklaras här följt av immunofenotypning genom flödescytometri. Denna teknik kräver mindre manuell hantering och orsakar mindre skada på den okulära ytan.
Impression cytology (IC) utfördes först 1977 i Thatcher et al . De använde en plasttryckskiva för att samla konjunktivalceller från patienter istället för andra tekniker som var tillgängliga vid den tiden, såsom skrapning, svabbning eller pipettering 1 . Den nuvarande tekniken av IC använder ett absorberande filterpapper 2 för att avtrycka bulbar och palpebral conjunctiva och samla det mest ytliga skiktet av konjunktivalceller. Dessa celler, som har nått sitt sista skede av differentiering, avgår kontinuerligt i tårar 3 . Tre stora populationer av celler finns i IC-prover: epitelceller 4 , bubbelceller 3 , 5 och mukosalassocierad lymfoidvävnad, viz epithelium-associerade effektor-T-celler eller dendritiska celler 6 . Okulära ytceller i IC samPles kan analyseras genom mikroskopi, immunblottning och revers-transkriptaspolymeraskedjereaktion (RT-PCR) 7 . Flödescytometri har nyligen använts för att analysera immunceller uppsamlade genom att skrapa IC-membranet 8 . Intressant har IC 6 , 9 använts för att utvärdera många okulära ytsjukdomar innefattande keratokonjunctivitssikka, vitamin A-brist, cikatrikial pemfigoid, atopisk sjukdom, överlägsen limbisk keratokonjunktivit, vernal keratokonjunktivit och epithelial-skivametaplasi. IC har också använts för att utvärdera effekterna av att bära kontaktlinser, detektera okulära ytmikrober och testa terapeutisk effekt och tolerans av terapeutiska ingrepp i longitudinella studier 10 , 11 , 12 .
Den medicinska enheten (EyePrim) stöds av en typ av polyEtersulfon (PES) 0,2 μm membran, som tidigare har validerats för tekniken för okulär intryckscytologi med flödescytometri (OSIC-flöde) och öppnar möjligheter att använda longitudinell provtagning för att övervaka sjukdomsprogression och respons på behandling ( t.ex. den detaljerade Analys av intraepiteliala leukocyter definierade som förmodade sjukdomsmarkörer för progressiv konjunktivalfibros i slemhinnans pemfigoid) 13 . Tidiga forskare använde autoklaverade PES-filter som krävde manuell visning. Som ett resultat var utbytet variabelt och användarberoende. Fördelen med denna medicinska enhet är användarvänlighet, standardiserat tryck (Pa eller N / m 2 ) och möjliggör repeterbarhet, reproducerbarhet och konsekvent cellåtervinning. Denna teknik är användbar i en klinik utanför kliniken eftersom den är icke-kirurgisk, lätt att utföra och snabbt. Detta är en medicinsk utrustning i klass I (steril) enligt direktiv 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Det kräver baraS aktuell anestesi under proceduren, vilket säkerställer upprätthållandet av okularytans integritet. Efter IC kan celler behandlas omedelbart för flödescytometri. Dessutom är det möjligt för icke-oftalmologiska tekniker och sjuksköterskor att utbildas för att prova den okulära ytan.
Trots förbättringen av IC över andra tekniker kvarstår flera utmaningar. Till exempel kan det finnas variation på grund av provtagningsområdet och regionala skillnader i bulbar-konjunktiv beroende på IC-positionen. En annan orsak till variation beror på användningen av olika mängder tryck under IC. Andra metodiska problem involverar standardisering av cellbearbetning: dessa innefattar varaktighet och fixeringsmetod samt villkoren för eventuell lagring, vilket kan påverka stabiliteten hos det provtagna materialet.
Det övergripande målet med denna teknik är att utveckla en metod för isolering av de okulära intrycksproverna thaT är lätt att använda, icke-invasiv och kan tillämpas på den immunologiska karakteriseringen av de kliniska proven.
Det här är en enkel, snabb och mindre invasiv teknik som kan användas i klinikerna för utomstående för relativt snabb immunprofilering i motsats till konventionella tekniker som skrapning, svabbning, pipettering eller absorberande filterpapper 1 , 2 . En variant av denna teknik används redan i forskningsinställningar 22 . Den framtida tillämpningen av den föreslagna metoden är för patientstratifiering i kliniska prövningar med okulära sjukdomar, särskilt de som kräver immunofenotypning.
En stor utmaning med denna teknik är de relativt få immunceller som hämtas efter intryckssamling och skrapning. Det totala antalet CD3 + T-celler som erhölls från fyra visningar per individ varierade från ~ 500-1000 celler. De okulära proven tvättades före flödescytometrianalysen för ett minimalt antal gånger för att undvika ytterligare förlust av cells. Kritiska steg och utmaningar som återstår inom protokollet är effektiv samling av okularprover och korrekt skrapning av membranet för att uppnå högre cellantal. Ändå är denna begränsning osannolikt att bias mot någon specifik immunfenotyp. Felsökning som utfördes här för att maximera utbytet av celler var att minska antalet tvättsteg efter och före inkubation av antikroppar.
Det finns andra begränsningar för att använda IC. Hos patienter med allvarligt keratiniserad eller fibroserad okulär yta, såsom i Steven Johnsons syndrom, kan det cellulära utbytet vara ännu mindre än det i denna studie. Andelen immunceller kan förändras om proven lagras istället för att analyseras samma dag. Det är svårt att förutsäga om vissa celltyper är mer resistenta mot lagring än andra. Tidigare studier har rapporterat förhöjda nivåer av HLA-DR-uttryck i konjunktivalepitelcellerna 23 , så det skulle vara interEsting att utvärdera korrelationen mellan HLA-DR och nivåer av specifika immunceller. Immunceller kan också associeras med expressionsnivån av kemokiner. Dessa frågor bör behandlas i framtida studier.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Nandini Nallappan och Sharon Yeo för att hjälpa till med de tekniska stegen. Studien finansierades av en Start-Up Grant till KGC från Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University och av ett Senior Clinician Scientist Award från Singapores ministerium för hälsa National Medical Research Council (NMRC) till LT (NMRC / CSA / 045/2012) och genom ett bidrag från NMRC och administreras av National Health Innovation Center till KGC och LT (NHIC-12D-1409007).
Reagents | |||
anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
Pippetes | Eppendorf | NA | |
Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipments | |||
Keratograph 5M | Oculus | NA | |
Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
EyePrim | Opia Technologies | NA | |
FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Softwares | |||
GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
FACSVerse analysis software | BD | NA |