Denne rapporten beskriver en metode for å indusere kronisk eksperimentelt autoimmuntørre øye i Lewis-rotter gjennom immunisering med en emulsjon av rottaklakkekstrakt, ovalbumin og fullstendig Freunds adjuvans, etterfulgt av injeksjon av lakrimalkjertrakt og ovalbumin i forniceal subkonjunktiva og lakrimalkjertler Seks uker senere.
Tørr øyesykdom er en svært vanlig tilstand som forårsaker sykelighet og helsetjenester byrde og reduserer livskvaliteten. Det er behov for en egnet tørre øyedyrmodell for å teste nye terapeutiske midler for å behandle autoimmune tørre øyeforhold. Denne protokollen beskriver en kronisk autoimmun tørr øye rotte modell. Lewis-rotter ble immunisert med en emulsjon inneholdende lakrimalkjoldekstrakt, ovalbumin og fullstendig Freunds adjuvans. En annen immunisering med de samme antigenene i ufullstendig Freunds adjuvans ble administrert to uker senere. Disse immuniseringene ble administrert subkutant ved halebunnen. For å øke immunresponsen ved den okulære overflaten og lacrimalkjertlene ble lacrimal kjertekstrakt og ovalbumin injisert i forniceal subconjunctiva og lacrimal kjertler 6 uker etter den første immuniseringen. Rottene utviklet tørre øyefunksjoner, inkludert redusert tåreproduksjon, redusert tårestabilitet og økt hornhindebeskadigelse. ImmunproArkivering ved hjelp av flytcytometri viste en overvekt av CD3 + effektorminne-T-celler i øyeballet.
Tørr øyesykdom (DED) er en multifaktorisk sykdom i tårene og den okulære overflaten som resulterer i ubehag, visuell forstyrrelse og ustabilitet i tårefilmen, noe som kan føre til skade på okularoverflaten. Det er ledsaget av økt osmolaritet av tårfilmen og ved betennelse i den okulære overflaten 1 . Symptomer forbundet med DED brenner, stikkende, grittiness, fremmedlegeme sensasjon, tåre, okular tretthet og tørrhet 2 , 3 . De to hovedårsakene til DED er redusert tåreproduksjon av tåresekretjonskjertelen og overdreven fordampning av tårfilmen 4 . Hos pasienter med autoimmune sykdommer, som Sjogren syndrom, systemisk lupus erythematosus og immunforstyrrelser i rheumatoid arthritis reduserer uttrykket av lipider som er essensielle for tårestabilitet. Dessuten reduserer immunskade på den okulære overflaten produktionenPå mucins viktig for overflate fuktighet. Sammen forårsaker disse prosessene kumulativt kronisk tørt øye 5 , 6 , 7 .
Tåreutskifting og antiinflammatorisk terapi er hovedstøtten til behandlingen. Men nåværende antiinflammatoriske terapier for DED ( dvs. kortikosteroider og cyklosporin) er stort sett immunosuppressive, noe som fører til alvorlige bivirkninger 8 , 9 , 10 . Det er behov for en egnet dyremodell for å teste nye immunmodulerende midler for å behandle autoimmun tørt øye.
Mus med spesifikke genetiske defekter 11 , 12 , 13 , mus som mangler spesifikke gener 14 , 15 og transgene mus som overuttrykker immunoregulatOrygener har blitt brukt som modeller for autoimmun tørt øye 16 , 17 . Antigeninducerte autoimmune dyremodeller har også blitt rapportert hos mus 18 , kaniner 19 og rotter 20 , 21 . Her beskriver vi en antigen-indusert modell av kronisk autoimmunt tørt øye. Denne modellen er en modifisering av to tidligere modeller; En brukte lacrimal kjertelekstrakter, og den andre brukte en autoantigen ( dvs. klk1b22) fra lacrimalkirtlene 20 , 21 .
Sykdommen ble indusert ved subkutan immunisering av 6 til 8 uker gamle kvinnelige Lewis-rotter med ovalbumin, komplett Freunds adjuvans og en emulsjon inneholdende lakrimalkjoldekstrakter fra Sprague-Dawley-rotter ( figur 1 ). En andre immunisering med det samme antigenet i ufullstendig Freunds adjuvans varAdministrert to uker senere. For å rekruttere antigenspesifikke immunceller til lacrimal kjertel og okular overflate ble injeksjon av lacrimal kjertelekstrakt og ovalbumin (1 mg / mL) injisert i forniceal subconjunctiva og lacrimalkjertene på 6. til 7. uke ( figur 1 ). Mer enn 85% av rotterne utviklet karakteristiske trekk ved tørt øye 70 dager etter den første immuniseringen. Disse funksjonene inkluderer redusert tåreproduksjon ( Figur 2 ), økt hornhindefluoresceinfarging ( Figur 3 ), og redusert tårestabilitet ( Figur 4 ). Immunprofilering av T-cellene i øynene av normale rotter ved hjelp av flytcytometri avslører en overvekt av CD3 + effektor-minne T-celler ( figur 5 og 6 ). Rotter med autoimmun DED viser en økning i CD3 + effektorminne-T-celler og en tilsvarende reduksjon i naive og sentrale minne T-celler ( figur 6 </strong>).
Et kritisk trinn i denne protokollen er å sikre emulsjonens homogenitet. I godt preparerte emulsjoner er antigenene fullstendig belagt med olje, noe som sikrer langsom frigjøring av det injiserte antigenet og kontinuerlig immunstimulering. En annen viktig egenskap ved denne protokollen er bruk av Lewis-rotter. Lewis-rotter er mer følsomme for utviklingen av autoimmun sykdom enn andre stammer 27 .
Denne protokollen er blitt modifisert fra to tidligere publiserte protokoller, som enten kun brukte lakrimal kjertekstrakt eller rekombinant Klk1b22 20 , 21 . I den nåværende protokollen brukes ovalbumin pluss lacrimal kjertekstrakt som antigenet, og antigen-spesifikke immunceller tiltrekkes den okulære overflaten og lacrimalkirtlen, noe som induserer lokal vevskader. Tørr øye utvikler sakte og når ~ 85% etter dag 48 etter den første immuniseringen. Antigenisk utfordring tilØye og lacrimal kjertel på dag 48 forverrer tørt øye og sikrer kroniskhet opp til dag 70.
Sammenlignet med det rekombinante Klk1b22 i den Klk-induserte DED-modellen, er lakrimalkjertekstraktet og ovalbuminet brukt i den nåværende modellen billigere og enklere å oppnå. Lacrimal kjertelekstraktet inneholder også andre proteiner, bortsett fra Klk, som kan indusere autoimmunitet, så dette ekstraktet er teoretisk mer potent enn Klk-metoden ved å indusere DED. Vi har også prøvd å immunisere rotter med lakrimale kjertekstrakt bare; Selv om disse immuniserte rotter utviklet DED, var det ingen signifikant økning av effektorminne-T-celler i øyebollvev sammenlignet med kontroller.
Begrensningen av denne teknikken er at det tar 70 dager å oppnå modellen. Effektminne T-celler er de viktigste T-celle-delene i det normale rotteøyet. I denne modellen resulterer autoimmune DED i en økning i CD3 + effector-minne T-celler i øyeeballet. Narkotika som prefSubstantielt undertrykke effektorminne T-celler, som selektive inhibitorer av Kv1.3 kaliumkanalen, kan derfor ha en terapeutisk fordel på autoimmun DED 28 .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Ms. Tin Min Qi og Dr. Veluchamy Amutha Barathi og hennes team for deres hjelp med å håndtere dyrene. Dette arbeidet ble støttet av NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 og NMRC / CSA / 045/2012.
Reagents | |||
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermal Scientific | 23227 | |
Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Becton, Dickinson and company | 231141 | |
complete Freund's adjuvant | Becton, Dickinson and company | 231131 | |
ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503-10G | |
incomplete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506-6X10ML | |
pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P7208-50UG | |
fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Sonicator | Sonics | Vibra-Cell | |
phenol red thread | Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD. | NA | |
Stereo microscope with ring light illuminator and camera | Carl Zeiss | NA | |
Micro IV microscope | Phoenix Research Labs | NA |