מתח הידוק פלואומטריה ב<em> קסנופוס</em> ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי
Summary
מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.
Abstract
מתח- Clamp Fluorometry (VCF) כבר טכניקה של בחירה כדי לחקור את המבנה ואת הפונקציה של חלבונים ממברנה electrogenic שבו בזמן אמת מדידות של פלואורסצנטי וזרמים בו זמנית לדווח על הסדרים מקומיים ופונקציה גלובלית, בהתאמה 1 . בעוד טכניקות מבניות ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ קרינה אלקטרונים או קריסטלוגרפיה רנטגן לספק תמונות סטטיות של חלבונים המעניינים, VCF מספק נתונים מבניים דינמיים המאפשר לנו לקשר את הסדרים מבניים (פלואורסצנציה) לנתונים פונקציונליים דינמיים (electrophysiology). עד לאחרונה, כימיה reiactive thiol המשמשים תיוג פלואורסצנטי מכוון האתר של חלבונים הגביל את היקף הגישה כי כל ציסטות נגיש, כולל אלה אנדוגניים, יסווגו. זה היה ולכן נדרש לבנות חלבונים ללא ציסטאין אנדוגני. תיוג היה מוגבל גם לאתרים נגישים מן החוץצַד. זה השתנה עם השימוש של חומצות אמינו פלואורסצנט לא טבעי (FUAA) כדי לכלול במיוחד בדיקה פלואורסצנטי קטן בתגובה לעצור דיכוי קודון באמצעות tRNA אורתוגונלית זוג synthetase tRNA 2 . שיפור VCF רק דורש הליך הזרקת שני שלבים של הזרקת דנ"א (זוג tRNA / synthetase) ואחריו RNA / FUAA שיתוף הזרקת. עכשיו, תיוג הן אתרי תאיים ו קבור אפשרי, ואת השימוש VCF התרחב באופן משמעותי. הטכניקה VCF ובכך הופך אטרקטיבי לחקר מגוון רחב של חלבונים – וחשוב יותר – מאפשר לחקור מנגנונים ציטוזוליים רבים.
Introduction
מעל 200 חומצות אמינו לא טבעיות של תכונות כימיות ופיסיקליות שונות שולבו גנטית בחלבונים בתאי E. coli , שמרים ותאי יונקים 3 . חומצת האמינו הלא טבעית משולבת בתגובה לקודון עצירה מסוים באמצעות זוג tRNA אורתוגונלי מהונדס / synthetase. הגישה הגנטית לשינוי חלבונים סיפקה תובנות חשובות על מבנה החלבון ותפקודו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מתח פלמורומטריה (VCF) בשילוב עם UAA פלואורסצנטי.
ב VCF, תצפית בו זמנית של נתונים פונקציונליים סידורים מבניים מקומי סביב בדיקה ניאון (~ 5 Å) מאפשר לנו להשיג מידע דינמי עם רזולוציה millisecond 1 . בדיקות פלואורסצנט לשנות מצב מרווה שלהם על התנועה המקומית של החלבון. תנועה של 1-2 רק מספיק כדי להוביל לשינויים משמעותיים הקרינהאינטנסיביות 4 . לאחר זיהוי של אתר של עניין בחלבון היעד, האתר הוא מוטציה על ידי מוטציה נקודה. באופן קלאסי, שאריות היה מוטציה על ציסטאין ואילו עכשיו, קודון להפסיק ענבר (TAG) הוא הציג עבור fUAA שילוב גנטי. החלבון הוא אז במבחנה transcribed.
בעוד מערכות ביטוי אחרות ( למשל, תאים יונקים) ניתן להשתמש 5 , 6 , 7 , ביציות Xenopus עדיפים על מבנה מבנה מחקרים בגלל גודל גדול שלהם, המוביל מניפולציה קלה יותר עוצמת הקרינה גבוהה יותר (fluorophores) ולכן, רעש. יתר על כן, ביציות Xenopus יש רקע נמוך מן החלבונים אנדוגני 2 , 8 , ואת פיגמנטציה כהה על המגן מוטות חיית נגד רקע הקרינה מהוא cytosol. ביציות Xenopus הם הוסרו כירורגית קידוד דנ"א tRNA אורתוגונליים / זוג tRNA-synthetase ספציפי עבור FUAA מוזרק לגרעין של הביציות. לאחר זמן הדגירה 6-24 שעות, RNA חלבון הוא שיתוף מוזרק עם FUAA לתוך cytosol של ביציות, ואחריו 2-3 ימים הדגירה תקופה. על מנת למנוע כל נזק fUAA (photobleaching), נהלים כולל אנאפ צריך להתבצע תחת אור אדום כדי למנוע עירור fluorophore.
ביציות נלמדים על חיתוך פתוח ביצית מתח ההתקנה, אשר מותקן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף, זרם חשמלי ושינויים הקרינה נרשמות בו זמנית 9 , 10 . לחלופין, שני אלקטרודה מתח מהדק 1 או תיקון תצורת מהדק 11 ניתן להשתמש. הקרינה נרגשת לאורכי גל מתאימים עם רעש RMS נמוך פליטה שנרשמה באמצעות photodiode מקושר למגבר עם הגברה גבוהה.
ישנם מספר יתרונות של שימוש פלואורסצנטי חומצות אמינו לא טבעיות (fUAAs) ב-מלחציים פלמפומטריה. האחד הוא גישה לצד cytosolic של חלבונים הממברנה; תהליכים רגולטוריים רבים נמצאים כאן ( למשל, Ca 2 + – או אתרי מחייב נוקליאוטידים, איטום מהיר וסגור המדינה של ערוצי יון מגודרת מתח, פתיחת הנקבוביות, צימוד מודול). כל התהליכים הללו נגישים כעת עבור תיוג פלואורסצנטי.
יתרון נוסף הוא גודל קטן של בדיקה המוביל פחות הפרעה של החלבון. עד כה, שני אורתוגונליים tRNA / tRNA זוגות synthetase עבור fUAAs כבר מהונדסים 12 , 13 , שם 3- (6-acetylnapthalen-2-ylamino) -2-aminopropanoic חומצה (Anap) הוא FUAA רק אשר שימש ביציות Xenopus 2 ,"Xref"> 8. Anap הוא fluorophore רגיש לסביבה עם משקל מולקולרי של 272.3 גרם / מול והוא רק מעט גדול יותר Tryptophan 12 ( דמויות 1A, 1B ). בשל גודלו הקטן, השפעות סטיות פחות צפויים להיות מיוצגים על ידי fluorophore לעומת fluorophores קונבנציונאלי המצורפת באמצעות מקשר (בדרך כלל יותר מ 500 g / mol). יתר על כן, במקרה של Anap, fluorophore ממוקם קרוב יותר עמוד השדרה חלבון מאשר אלה הקשורים ציסטאין, וכתוצאה מכך, Anap הוא חיטוט סידורים מקומיים יותר. לבסוף, הסרת ציסטאין אנדוגני ב VCF קונבנציונאלי על מנת להבטיח תיוג אתר ספציפי כבר לא דרישה UAA-VCF ולכן (i) משאיר את החלבונים ב (כמעט) המדינה שלהם יליד (ii) מאפשר VCF להיות מיושם כדי ללמוד מגוון רחב יותר של חלבונים בהם פונקציה עשויה להשתנות על ידי החלפת ציסטאין.
<img alt="איור 1" src = "/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg" />
איור 1 : Anap ו פלואורסצנטי ספקטרה. ( א ) המבנה הכימי של אנאפ. ( ב ) ספקטרום ספיגה מנורמל ספקטרום פליטה עבור 1 ננומטר אנאפ, המדגים את הרגישות של הקרינה אנאפ כדי הידרופובייה ממס. ספקטרום פליטה התקבלו על ידי מרגש ב 350 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
החיסרון של שימוש UAAs פלואורסצנטי הוא אוכלוסייה הטרוגנית של חלבונים עלולה לנבוע מקריאת קודון להפסיק, reinitiation translational, C- מסוף חתכים מקוצצים או crosstalk עם aminoacylation אנדוגני אם כמות tRNAs aminoacylated הוא נדיר. ביטוי דליפה כזה צריך תמיד להיות בדק עבור בהעדר fUAA ו tRNA / tRNA זוג synthetase. התייחסנו לסוגיית הטרנסLational reinitiation וכיצד לעקוף אותו עבור N- מסוף אתרי הכניסה בעבר 14 . עם זאת, כאשר fUAA, tRNA ו tRNA synthetase נמצאים בכמויות רווי, נותרה רק הסתברות נמוכה של ביטוי דליפה.
ההבדל הפרוצדוראלי העיקרי בין FUAA-VCF לבין VCF קונבנציונאלי הוא הזרקת וטיפול ביציות; הזרקת דנ"א קידוד tRNA ו tRNA synthetase (pAnap) ואחריו המבוא של Anap, אשר גם שיתוף מוזרק עם mRNA חלבון או לחלופין הוסיף פתרון הדגירה כמו אסתר acetoxymethyl (AM).
Protocol
Representative Results
Discussion
ב aminoacylation in vivo של tRNAs אשר מתמשכים ברציפות יחד עם tRNA-synthetase, מאפשר להשיג רמות ביטוי גבוהות מדידות הקרינה. עבור שילוב FUAA יעיל, זה קריטי כי pAnap מוזרק כראוי לתוך הגרעין. בשל חוסר הוודאות של המיקום המדויק של הגרעין, 10-40% מהזרקת ה- DNA צפויים להיכשל, וכתוצאה מכך לא הביעו ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAnap היה מתנה אדיבה של ד"ר פיטר שולץ (מכון המחקר Scripps). עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מענקי מחקר MOP-102689 ו MOP-136894 (ל RB) וקרן קנדה למענק חדשנות 950-225005.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
References
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
