Een methode voor de productie van recombinante eiwitten mCD1d in insectencellen.
Summary
Een methode om Insectencellen voor te bereiden en te infecteren ze met baculovirus voor het doel van de productie van recombinante mCD1d proteinand het genereren van mCD1d tetrameren.
Abstract
CD1 eiwitten vormen een derde klasse van antigeen-presenterende moleculen. Ze zijn celoppervlak glycoproteïnen, uitgedrukt als ongeveer 50-kDa geglycosyleerd zware ketens die niet-covalent geassocieerd zijn met beta2-microglobuline. Ze binden lipiden in plaats van peptiden. Hoewel de structuur bevestigt de gelijkenis van CD1 eiwitten MHC klasse I en klasse II antigeen presenterende moleculen, de mCD1d groef is relatief smal, diep en zeer hydrofoob en heeft twee bindende zakken in plaats van de verschillende ondiepe zakken beschreven voor de klassieke MHC- gecodeerde antigen-presenterende moleculen. Op basis van hun aminozuursequenties, zoals een hydrobphobic groef biedt een ideale omgeving voor de binding van lipide antigenen.
De Natural Killer T (NKT) cellen gebruiken hun TCR om glycolipids gebonden aan of door CD1d herkennen. T-cellen reactief naar lipiden gepresenteerd door CD1 betrokken zijn geweest bij de bescherming tegen auto-immuun-en infectieziekten en in tumor afwijzing. Zo, de mogelijkheid om te identificeren, te zuiveren en volgen de reactie van CD1-reactieve NKT cel is van groot belang. Het genereren van tetrameren van alpha galactosyl ceramide (een-Galcer) met CD1d heeft belangrijke inzicht in de biologie van NKT cellen. Tetrameren opgebouwd uit andere CD1 moleculen zijn ook gegenereerd en deze nieuwe reagentia zijn sterk uitgebreid de kennis van de functies van lipide-reactieve T-cellen, met potentieel gebruik bij het toezicht op de respons op lipide-gebaseerde vaccins en in de diagnose van auto-immuunziekten en andere behandelingen.
Protocol
Discussion
In deze procedure wordt aangetoond hoe te starten, groeien, infecteren cellen Insect en hoe u het baculovirus het gebruik van deze cellen titer. De belangrijkste aspecten van deze procedure is het onderhoud van cellen en om de exacte titer van baculovirus kennen. Als je eenmaal hebt CD1 tetrameren gegenereerd, kunnen ze worden gebruikt als een krachtig instrument voor de analyse van glycolipide reactieve T-cellen. Baculovirus systemen worden ook veel gebruikt voor recombinante eiwitten, met inbegrip van MHC klasse II tetrameren dus deze pro…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probe | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Naidenko, O. V., Maher, J. K., Ernst, W. A., Sakai, T., Modlin, R. L., Kronenberg, M. Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
