العزلة في وقت واحد من كارديوميوسيتس عالية الجودة، الخلايا البطانية، والألياف الليفية من القلب الجرذ الكبار
Summary
وقد وضعت العديد من البروتوكولات ووصف لعزل أنواع مختلفة من خلايا القلب من القلب الفئران. هنا، يوصف بروتوكول الأمثل الذي يسمح لعزل عالية الجودة أنواع الخلايا القلب الرئيسية (الخلايا العضلية، الخلايا البطانية، والألياف الليفية) من إعداد واحد، والحد من التكاليف التجريبية.
Abstract
الفئران هو نموذج حيواني مهم المستخدمة في البحوث القلب والأوعية الدموية، وتستخدم خلايا القلب الفئران بشكل روتيني لتحليل المختبر من الآليات الجزيئية للتقدم أمراض القلب والأوعية الدموية مثل تضخم القلب والتليف وتصلب الشرايين. على الرغم من أن العديد من المحاولات مع نجاح متغير قد أحرزت لتطوير خطوط الخلايا خلد من نظام القلب والأوعية الدموية لفهم هذه الآليات الخلوية، والخلايا الأولية توفر أكثر طبيعية وقريبة من البيئة في الجسم الحي لمثل هذه الدراسات. لذلك، مختبرات مختلفة تعمل على نوع خلية معينة وضعت بروتوكولات لعزل أنواع فردية من خلايا القلب الفئران من الفائدة. ومع ذلك، هناك بروتوكول يسمح لعزل أكثر من نوع خلية واحدة، غير موجود. هنا يوصف بروتوكول الأمثل الذي يسمح لعزل عالية الجودة أنواع خلايا القلب الرئيسية (الخلايا العضلية، الخلايا البطانية، والألياف الليفية) من إعداد واحد وتمكن ثيr للاستخدام في التحليلات الخلوية. ويسمح ذلك بأكفأ استخدام للموارد المتاحة، مما قد يوفر الوقت ويقلل من تكاليف البحث.
Introduction
وقد استخدمت منذ فترة طويلة نماذج القوارض كأدوات لتوسيع فهمنا لعلم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية في الصحة والمرض. 1 على الرغم من أن هذه النماذج الحيوانية تسمح لنا لفهم الفيزيولوجيا المرضية للمرض على مستوى الجهاز وتحليل الدوائية والديناميكا الدوائية من مختلف العوامل الدوائية المستخدمة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية، وفهم الآليات الجزيئية للتطور أمراض القلب والأوعية الدموية ومساهمة معين نوع الخلية يتطلب استخدام في المختبر نماذج زراعة الخلايا. لهذا الغرض تم تطوير خطوط خلوية مختلفة من نظام القلب والأوعية الدموية؛ 2 ، 3 ومع ذلك، الخلايا الأولية المعزولة حديثا هي من الناحية الفسيولوجية والوظيفية أكثر ملاءمة للأنسجة الحية والكائنات الحية.
القلب هو جهاز تنوعا يحتوي على جميع أنواع رئيسية من خلايا القلب والأوعية الدموية قيستم، وقلب الفئران لا يزال نموذجا شائع الاستخدام لفهم علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية. خلال العقود القليلة الماضية، تم وصف طرق مختلفة لعزل أنواع الخلايا الفردية من أنسجة القلب. 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، ولكن هذه الأساليب تركز فقط على عزل نوع واحد من الخلايا المحددة مما أدى إلى فقدان أنواع أخرى من الخلايا التي لم تعد تستخدم للتحليل الخلوي. هنا، يتم وصف بروتوكول الأمثل التي تمكن العزلة في وقت واحد وعالية الجودة من أنواع الخلايا الرئيسية من أنسجة القلب، أي الخلايا العضلية، الخلايا البطانية، والألياف الليفية. كل هذه الأنواع من الخلايا يمكن استخدامها في الاجهزة التجريبية المختلفة 8 ، 9 ، 10 ولتحليل التفاعلات خلية الخلية من نفس الحيوان.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، يتم وصف بروتوكول استنساخ لعزل وثقافة ميوسيتس القلب، الخلايا البطانية، والألياف الليفية. يصف هذا البروتوكول العزلة في وقت واحد وعالية الجودة من أنواع الخلايا الرئيسية من الأنسجة القلبية، أي خلايا عضلية، الخلايا البطانية، والخلايا الليفية في مق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدعم الفني من L. رينالدي، S. شافير، D. ريتز، H. توماس و A. ويبر هو مع الامتنان بشكر. ويود المؤلفون أيضا أن يشكروا الدكتور إ. مارتينسون على قراءته المكثفة للطباعة والتحرير اللغوي للمخطوطة. وأيد الدراسة من قبل جامعة جيسن أنسكوبسفينانزيرونغ منحة ل M. أسلم و D. غوندوز.
Materials
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
References
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
