Ekstraktion og oprensning af polyphenoler fra frysetørret bærpulver til behandling af vaskulære glatte muskelceller<em> In Vitro</em

Summary

Dette arbejde beskriver en trin-for-trin metode til fremstilling af polyphenol-rige ekstrakter fra frysetørret bærpulver. Derudover giver den en grundig beskrivelse af, hvordan man bruger disse polyphenolrige ekstrakter i cellekultur i nærvær af peptidhormon angiotensin II (Ang II) ved hjælp af vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er).

Abstract

Epidemiologiske undersøgelser tyder på, at øget flavonoid indtagelse korrelerer med nedsat dødelighed på grund af hjerte-kar-sygdomme (CVD) i USA og USA. Bær er meget forbrugt i USA og har et højt polyphenolisk indhold. Polyfenoler har vist sig at interagere med mange molekylære mål og udøve adskillige positive biologiske funktioner, herunder antioxidant, antiinflammatoriske og kardioprotektive virkninger. Polyfenoler isoleret fra blackberry (BL), hindbær (RB) og sort hindbær (BRB) reducerer oxidativ stress og cellulær senescence som svar på angiotensin II (Ang II). Dette arbejde giver en detaljeret beskrivelse af protokollen, der anvendes til fremstilling af polyphenolekstrakterne fra frysetørrede bær. Polyphenolekstraktioner fra frysetørret bærpulver blev udført under anvendelse af 80% vandig ethanol og en ultralydassisteret ekstraktionsmetode. Det rå ekstrakt blev yderligere oprenset og fraktioneret under anvendelse af chloroform og ethylacetat,henholdsvis. Virkningerne af både rå og oprensede ekstrakter blev testet på vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) i kultur.

Introduction

Polyfenoler er forbindelser indeholdende mindst en phenolisk ring i deres struktur og er rigeligt til stede i planteområdet ¹ . Mennesker har brugt planter i årtusinder til medicinske formål uden at være opmærksom på eksistensen af ​​sådanne forbindelser ² . Mange frugter og grøntsager har nogle delte polyphenoliske forbindelser, om end med forskellige mængder, herunder flavonoider, stilbener og phenol syrer ³ . Selvom polyfenoler ofte er forbundet med farverige frugter og grøntsager, er dette ikke strengt sandt. For eksempel er zeaxanthin og xanthin til stede i grøntsager, der ikke er yderst farverige, såsom løg og hvidløg, der er fra familien af ​​scallions og er forbundet med mange sundhedsmæssige fordele ⁴ . Bortset fra at være forbundet med flere sundhedsmæssige fordele ⁵ , tjener polyphenoler også planter ved at beskytte dem mod insekterD ultraviolet stråling ² . Polyfenoler findes almindeligvis i den menneskelige kost og betragtes som kraftige antioxidanter, da de kan scavenge Reactive Oxygen Species (ROS) ^{6 , 7 , 8} . De har også antiinflammatoriske ⁹ , antimikrobielle ¹⁰ , antihypertensive ¹¹ og anti-kræftfremkaldende ^{12 , 13} egenskaber.

Epidemiologiske undersøgelser viser en invers forbindelse mellem forbruget af flavonoider og kardiovaskulær sygdom (CVD) incidensen ^{16 , 17} og dødelighed ^{14 , 15} . Bær er meget forbrugt i USA og har store mængder polyphenoler, herunder flavonoider. For eksempel forbrug af blackberry (BL) juice (300 ML / d) i otte uger signifikant nedsat systolisk blodtryk hos dyslipidemiske patienter ¹⁸ . Jeong et al. ¹⁹ rapporterede, at prehypertensive mænd og kvinder forbruge 2,5 g sort hindbær (BRB) ekstrakt om dagen havde lavere 24-timers og nattt blodtryk sammenlignet med dem, der indtog en placebo. Hindbær (RB) reducerede blodtrykket, mens ekspression af superoxiddismutase (SOD) blev øget hos spontant hypertensive rotter ²⁰ . Det har for nylig vist sig, at BL, RB og BRB reducerer niveauerne af ROS og senescence induceret af angiotensin II (Ang II) i vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) ²¹ . Desuden reducerede anthocyaninfraktionen fra BL-ekstrakt ekspressionen af ​​inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS) og inhiberede aktiviteten af ​​Nuclear Factor kappa B (NF-KB) og ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK) i lipopolysaccharid (LPS) -stimuleret J774 cellerAss = "xref"> 22. BRB-ekstrakter reducerede NF-KB-aktiveringen og cyclooxygenase 2 (COX-2) -expressionen in vitro ²³ , forbedrede lipidprofilen og forhindrede atheroscleroselæsionsdannelse hos mus, der fodrede en fedtholdig diæt ²⁴ . Anthocyaniner, der betragtes som de mest omfattende flavonoider i bær, modulerer det inflammatoriske respons i LPS-stimulerede RAW 264.7-makrofager ved at reducere Tumor Necrosis Factor alfa (TNF-a) -produktion ²⁵ og reducere proliferationen og migreringen af ​​VSMC'er ²⁶ .

Da der har været voksende interesse for at forstå polyphenols rolle i menneskers sundhed og sygdom, er det vigtigt at optimere ekstraktionsmetoden. Opløsningsmiddeludvindingen bruges i vid udstrækning til det formål, da det er omkostningseffektivt og let reproducerbart. I denne undersøgelse blev en opløsningsmiddelekstraktion anvendt med ethanol sammen med en ultralydassisteret ekstraktionN-metode, som blev tilpasset fra Kim og Lee ²⁷ . Rensningen og fraktioneringen af ​​råekstrakter (CE) under anvendelse af chloroform og ethylacetat blev udført for at opnå den oprensede ekstrakt (PE) fraktion, som var tilpasset fra Queires et al. ²⁸ . Endvidere blev effektiviteten af ​​rå versus oprensede polyphenolekstrakter fra BL sammenlignet med BL ved reduktion af den basale phosphorylering af ERK1 / 2 sammenlignet, og repræsentative eksempler på den inhibitoriske virkning af oprenset BL-polyphenolekstrakt på Ang II-inducerede signalreduktioner i VSMC'er blev tilvejebragt.

Protocol

1. Fremstilling af reagenser Tilbered 80% ethanol (100 ml) ved at blande 80 ml absolut ethanol (molekylærbiologi-grade) og 20 ml steriliseret cellekulturklasse. For at forberede polyphenol ekstrakt (10 mg / ml), veje 10 mg CE eller PE. Tilsæt 1 ml almindeligt Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) under en cellekulturhætte. Vortex opløsningen. Aliquot i 200 μl portioner og opbevar ved -20 ° C. Forbered lysis buffer. Tilsæt 5 ml 1 M HEPES stamopløsning (pH 7,4; 50 mM e…

Representative Results

Det er tidligere blevet påvist, at polyphenolekstrakter isoleret fra BL, RB og BRB reducerede senescensen af ​​VSMC'er som svar på Ang II 21 . Det har vist sig, at disse oprensede polyphenolekstrakter modulerer Ang II-signalering ved at reducere phosphoryleringen af ​​Akt, p38-mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og ERK1 / 2. BL forhindrer senescens ved at reducere ekspressionen af ​​NADPH oxidasen (Nox) 1, et enzym der producerer superoxidanion…

Discussion

Polyfenoler isoleret fra bær indeholder tydelige præparater. Den her beskrevne ethanolbaserede ekstraktionsprotokol tillader identifikation af forskellige niveauer af phenol syrer og flavonoider, der findes i rå og rensede polyphenolekstrakter af BL ( tabel 1 ). CE blev beriget i gallinsyre, ferulinsyre, 4-0-caffeoylquininsyre og 5-0-caffeoylquininsyre. Renseprocessen ændrede ikke signifikant niveauerne af gallinsyre og p-coumarsyre. Det øgede imidlertid niveauerne af 3- O- caffeoylquinins…

Materials

Angiotensin II	Sigma-Aldrich, Inc.	A9525-10MG	Treatment of VSMCs
β-actin	Sigma-Aldrich, Inc.	A2228	Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit	Mercer Foods		Freeze-dried blackberry powder
Catalase	Calbiochem	219010	Primary antibody (1:1000)
Chloroform	Biotech Grd, Inc.	97064-678	Preparation of purified polyphenol extracts
DMEM	Mediatech, Inc.	10-014-CV	Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade)	Sigma-Aldrich, Inc.	E7023-500ML	Preparation of polyphenol extracts
Ethylacetate	Sigma-Aldrich, Inc.	439169	Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9102S	Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0	Teknova, Inc.	E0306	Lysis buffer
Freeze-Dryer	Labconco	VirTis Benchtop K	Preparation of polyphenol extracts
FBS	Seradigm	1400-500	Cell culture
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375	Lysis buffer
NaCl	EMD Millipore, Inc.	7760	Lysis buffer
NaF	J.T.Baker, Inc.	3688-01	Lysis buffer
Na3VO4	Sigma-Aldrich, Inc.	450243	Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate	Sigma-Aldrich, Inc.	S-9515	Lysis buffer
phospho ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9101S	Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich, Inc.	P8340-5ml	Lysis buffer
Protein assay dye reagent	Bio-Rad Laboratories, Inc.	500-0006	Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane	Thermo Scientific, Inc.	88518	Western blots
Rotatory Evaporator	Buchi Labortechnik	Rotavapor R3000	Preparation of polyphenol extracts
Sterile water	Mediatech, Inc.	25-055-CV	Preparation of polyphenol extracts
Sonicator	QSonica, LLC	Q125	Preparation of cell extracts
SOD2	Enzo Life Sciences, Inc.	ADI-SOD-110-F	Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich, Inc.	X100	Western blots
Whatman #2 filter paper	GE Healthcare, Inc.	28317-241	Preparation of polyphenol extracts