Extraction et purification des polyphénols à partir de la poudre de baies lyophilisée pour le traitement des cellules musculaires lisses vasculaires<em> In Vitro</em
Summary
Ce travail détaille une méthode étape par étape pour préparer des extraits riches en polyphénols à partir de poudres de baies lyophilisées. En outre, il fournit une description détaillée de la façon d'utiliser ces extraits riches en polyphénols dans la culture cellulaire en présence de l'hormone peptidique angiotensine II (Ang II) à l'aide de cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC).
Abstract
Des études épidémiologiques indiquent que l'augmentation de la consommation de flavonoïdes est en corrélation avec la diminution de la mortalité due aux maladies cardiovasculaires (ECV) aux États-Unis (États-Unis) et en Europe. Les baies sont largement consommés aux États-Unis et ont un contenu polyphénolique élevé. On a montré que les polyphénols interagissent avec de nombreuses cibles moléculaires et exercent de nombreuses fonctions biologiques positives, y compris les effets antioxydants, anti-inflammatoires et cardioprotecteurs. Les polyphénols isolés de la mûre (BL), de la framboise (RB) et de la framboise noire (BRB) réduisent le stress oxydatif et la sénescence cellulaire en réponse à l'angiotensine II (Ang II). Ce travail fournit une description détaillée du protocole utilisé pour préparer les extraits de polyphénols à partir de baies lyophilisées. Les extractions de polyphénols à partir de poudre de baies lyophilisées ont été réalisées en utilisant de l'éthanol aqueux à 80% et un procédé d'extraction assisté par ultrasons. L'extrait brut a été encore purifié et fractionné en utilisant du chloroforme et de l'acétate d'éthyle,respectivement. Les effets des extraits bruts et purifiés ont été testés sur des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) en culture.
Introduction
Les polyphénols sont des composés contenant au moins un anneau phénolique dans leur structure et sont abondamment présents dans le règne végétal 1 . Les humains ont consommé des plantes pendant des millénaires à des fins médicales sans connaître l'existence de tels composés 2 . Beaucoup de fruits et légumes ont des composés polyphénoliques partagés, bien qu'avec des quantités différentes, y compris les flavonoïdes, les stilbènes et les acides phénoliques 3 . Bien que les polyphénols soient souvent associés à des fruits et légumes colorés, cela n'est pas strictement vrai. Par exemple, la zéaxanthine et la xanthine sont présentes dans les légumes qui ne sont pas très colorés, comme les oignons et l'ail, qui proviennent de la famille des écrevisses et sont associés à de nombreux avantages pour la santé 4 . En plus d'être associé à plusieurs avantages pour la santé 5 , les polyphénols servent également les plantes en les protégeant des insectes etD rayonnement ultraviolet 2 . Les polyphénols sont couramment présents dans l'alimentation humaine et sont considérés comme des antioxydants puissants, car ils peuvent éliminer les espèces d'oxygène réactif (ROS) 6 , 7 , 8 . Ils ont également des propriétés anti-inflammatoires 9 , antimicrobiennes 10 , anti-hypertensives 11 et anti-cancérogènes 12 , 13 .
Les études épidémiologiques démontrent une association inverse entre la consommation de flavonoïdes et l'incidence des maladies cardiovasculaires (MCV) 16 , 17 et la mortalité 14 , 15 . Les baies sont largement consommés aux États-Unis et ont une grande quantité de polyphénols, y compris les flavonoïdes. Par exemple, la consommation de jus de mûre (BL) (300 ML / d) pendant huit semaines a diminué de manière significative la tension artérielle systolique chez les patients dyslipidémiques 18 . Jeong et al. 19 ont rapporté que les hommes et les femmes pré-hypertendus consommant 2,5 g d'extrait de framboise noire (BRB) par jour avaient une pression artérielle inférieure de 24 h et une nuit par rapport à ceux qui consommaient un placebo. Les framboises (RB) ont diminué la tension artérielle tout en augmentant l'expression de la superoxyde dismutase (SOD) chez les rats spontanément hypertendus 20 . Il a récemment été démontré que BL, RB et BRB réduisent les niveaux de ROS et de sénescence induite par l'angiotensine II (Ang II) dans les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) 21 . De plus, la fraction anthocyanique de l'extrait BL a réduit l'expression de l'oxyde nitrique synthase inducible (iNOS) et a inhibé l'activité du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et de la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK) dans le lipopolysaccharide (LPS) – stimulée Cellules J774Ass = "xref"> 22. Les extraits de BRB ont diminué l'activation NF-κB et l'expression de la cyclooxygénase 2 (COX-2) in vitro 23 , amélioré le profil lipidique et empêché la formation de la lésion de l'athérosclérose chez des souris nourries avec un régime riche en matières grasses 24 . Les anthocyanines, qui sont considérées comme les flavonoïdes les plus abondants dans les baies, modulent la réponse inflammatoire dans les macrophages RAW 264.7 stimulés par le LPS en diminuant la production de facteur 25 de nécrose tumorale (TNF-α) 25 et en diminuant la prolifération et la migration des VSMC 26 .
Étant donné qu'il y a eu un intérêt grandissant à comprendre le rôle des polyphénols dans la santé humaine et les maladies, il est important d'optimiser la méthode d'extraction. L'extraction par solvants est largement utilisée à cette fin, car elle est rentable et facilement reproductible. Dans cette étude, une extraction par solvant a été utilisée avec de l'éthanol, avec une extraction assistée par ultrasonsN méthode, qui a été adaptée de Kim et Lee 27 . La purification et le fractionnement des extraits bruts (CE) à l'aide de chloroforme et d'acétate d'éthyle ont été réalisés pour obtenir la fraction d'extrait purifié (PE) adaptée de Queires et al 28 . En outre, on a comparé l'efficacité des extraits de polyphénols bruts versus purifiés de BL pour réduire la phosphorylation basale de ERK1 / 2 et des exemples représentatifs de l'effet inhibiteur de l'extrait de polyphénol BL purifié sur les réductions de signalisation induites par Ang II dans les VSMC ont été fournis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les polyphénols isolés des baies contiennent des compositions distinctes. Le protocole d'extraction à base d'éthanol décrit ici a permis d'identifier différents niveaux d'acides phénoliques et de flavonoïdes présents dans des extraits de polyphénols bruts et purifiés de BL ( Tableau 1 ). CE a été enrichi en acide gallic, en acide ferulique, en acide 4-O-caffeoylquinique et en acide 5-O-caffeoylquinique. Le processus de purification n'a pas modifié de manière significat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par l'American Heart Association (14GRNT20180028) et le Florida State University Council on Research and Creativity (COFRS).
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
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