Экстракция и очистка полифенолов от лиофилизированного порошка ягод для лечения сосудистых гладких мышечных клеток<em> In Vitro</em
Summary
В этой работе подробно описан пошаговый способ получения экстрактов, богатых полифенолом, из лиофилизированного порошка ягод. Кроме того, он дает подробное описание того, как использовать эти богатые полифенолом экстракты в культуре клеток в присутствии пептидного гормона ангиотензина II (Ang II) с использованием сосудистых гладких мышечных клеток (VSMCs).
Abstract
Эпидемиологические исследования показывают, что увеличение потребления флавоноидов коррелирует со снижением смертности от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в США (США) и Европе. Ягоды широко потребляются в США и имеют высокий полифенольный состав. Было показано, что полифенолы взаимодействуют со многими молекулярными мишенями и оказывают множество положительных биологических функций, включая антиоксидантные, противовоспалительные и кардиозащитные эффекты. Полифенолы, выделенные из ежевики (BL), малины (RB) и черной малины (BRB), снижают окислительный стресс и клеточное старение в ответ на ангиотензин II (Ang II). В этой работе приводится подробное описание протокола, используемого для получения полифенольных экстрактов из лиофилизированных ягод. Выделение полифенолов из лиофилизированного порошка ягод осуществляли с использованием 80% -ного водного этанола и метода экстракции ультразвуком. Неочищенный экстракт далее очищали и фракционировали с использованием хлороформа и этилацетата,соответственно. Эффекты как сырых, так и очищенных экстрактов были протестированы на сосудистых гладких мышечных клетках (VSMC) в культуре.
Introduction
Полифенолы представляют собой соединения, содержащие по крайней мере одно фенольное кольцо в своей структуре и обильно присутствуют в растительном царстве 1 . Люди потребляют растения в течение тысячелетий в медицинских целях, не зная о существовании таких соединений 2 . Многие фрукты и овощи имеют некоторые общие полифенольные соединения, хотя и с различными количествами, включая флавоноиды, стильбены и фенольные кислоты. 3 . Хотя полифенолы часто ассоциируются с красочными фруктами и овощами, это не совсем верно. Например, зеаксантин и ксантин присутствуют в овощах, которые не очень яркие, такие как лук и чеснок, которые принадлежат к семейству луков и связаны с многочисленными преимуществами для здоровья 4 . Помимо того, что они связаны с несколькими преимуществами для здоровья 5 , полифенолы также служат растениям, защищая их от насекомых,D ультрафиолетовое излучение 2 . Полифенолы обычно встречаются в рационе человека и считаются мощными антиоксидантами, поскольку они могут собирать реактивные виды кислорода (ROS) 6 , 7 , 8 . Они также имеют противовоспалительные 9 , антимикробные 10 , антигипертензивные 11 и антиканцерогенные 12 , 13 свойства.
Эпидемиологические исследования демонстрируют обратную связь между потреблением флавоноидов и сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) 16 , 17 и смертностью 14 , 15 . Ягоды широко потребляются в США и содержат большое количество полифенолов, включая флавоноиды. Например, потребление сока ежевики (BL) (300 Мл / д) в течение восьми недель значительно уменьшалось систолическое артериальное давление у пациентов с дислипидемией 18 . Jeong et al. 19 сообщили, что у мужчин и женщин с гипертензией, потребляющих 2,5 г экстракта черной малины (BRB) в день, было более низкое 24-часовое и ночное кровяное давление по сравнению с теми, кто потреблял плацебо. Малина (RB) уменьшала артериальное давление, увеличивая экспрессию супероксиддисмутазы (SOD) у спонтанно гипертензивных крыс 20 . Недавно было показано, что BL, RB и BRB снижают уровни РОС и старения, вызванные ангиотензином II (Ang II) в сосудистых гладких мышечных клетках (VSMC) 21 . Кроме того, антоцианиновая фракция из экстракта BL уменьшала экспрессию индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) и ингибировала активность ядерного фактора kappa B (NF-κB) и внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK) в липополисахариде (LPS) -стимулированной Ячейки J774Ass = "xref"> 22. Экстракты BRB уменьшали экспрессию NF-κB и циклооксигеназы 2 (COX-2) in vitro 23 , улучшали профиль липидов и предотвращали образование атеросклероза у мышей, которым кормили диету с высоким содержанием жиров 24 . Антоцианины, которые считаются наиболее распространенными флавоноидами в ягодах, модулируют воспалительную реакцию в LPS-стимулированных макрофагах RAW 264.7 путем уменьшения производства альфа-фактора (NFRO-α) фактора роста опухоли 25 и уменьшают пролиферацию и миграцию VSMCs 26 .
Поскольку растет интерес к пониманию роли полифенолов в здоровье и болезни человека, важно оптимизировать метод извлечения. Для этой цели широко используется экстракция растворителем, так как она экономична и легко воспроизводима. В этом исследовании использовали экстракцию растворителем с этанолом наряду с экстрактом ультразвукаN, который был адаптирован из Ким и Ли 27 . Очистку и фракционирование сырых экстрактов (CE) с использованием хлороформа и этилацетата проводили для получения фракции очищенного экстракта (PE), которая была адаптирована из Queires et al. 28 . Кроме того, сравнивали эффективность неочищенных и очищенных полифенольных экстрактов из BL при восстановлении базального фосфорилирования ERK1 / 2 и были представлены типичные примеры ингибирующего действия очищенного экстракта полифенола BL на Ang-индуцированные передачи сигналов в VSMC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Полифенолы, выделенные из ягод, содержат различные композиции. Протокол извлечения этанола, описанный здесь, позволил идентифицировать различные уровни фенольных кислот и флавоноидов, присутствующих в неочищенных и очищенных полифенольных экстрактах BL ( таблица 1 ). CE был обо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Американской кардиологической ассоциацией (14GRNT20180028) и Советом Университета штата Флорида по исследованиям и творчеству (COFRS).
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
- Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions–a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
- Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
- Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
- Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
- Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity?. Crit Rev Food Sci Nutr. 56, S46-S59 (2016).
- Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
- Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
- Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
- Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
- Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
- Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
- Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
- Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
- Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
- Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
- Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
- Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
- Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
- Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
- Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
- Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
- Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
- Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
- Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, 2.1-2.12 (2002).
- Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
- Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
- Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).
