Extraktion och rening av polyfenoler från frystorkat bärpulver för behandling av vaskulära glatta muskelceller<em> In Vitro</em
Summary
Detta arbete beskriver en steg-för-steg-metod för att förbereda polyphenolrika extrakt från frystorkat bärpulver. Dessutom ger den en grundlig beskrivning av hur man använder dessa polyphenolrika extrakt i cellkultur i närvaro av peptidhormon angiotensin II (Ang II) med hjälp av vaskulära smala muskelceller (VSMC).
Abstract
Epidemiologiska studier indikerar att ökat flavonoidintag korrelerar med minskad dödlighet på grund av hjärt-kärlsjukdomar (CVD) i Förenta staterna (USA) och Europa. Bär konsumeras ofta i USA och har ett högt polyphenoliskt innehåll. Polyfenoler har visat sig interagera med många molekylära mål och utöva många positiva biologiska funktioner, inklusive antioxidant, antiinflammatoriska och hjärtskyddande effekter. Polyfenoler isolerade från brombär (BL), hallon (RB) och svart hallon (BRB) reducerar oxidativ stress och cellulär senescens som svar på angiotensin II (Ang II). Detta arbete ger en detaljerad beskrivning av protokollet som används för att framställa polyphenol-extrakten från frystorkade bär. Polyfenol extraktioner från frystorkat bärpulver utfördes med användning av 80% vattenhaltig etanol och en ultraljudassisterad extraktionsmetod. Råtextraktet renades ytterligare och fraktionerades med användning av kloroform och etylacetat,respektive. Effekterna av både råa och renade extrakt testades på vaskulära smala muskelceller (VSMCs) i odling.
Introduction
Polyfenoler är föreningar som innehåller minst en fenolisk ring i sin struktur och är rikligt närvarande i växtriket 1 . Människor har konsumerat växter i årtusenden för medicinska ändamål utan att vara medvetna om förekomsten av sådana föreningar 2 . Många frukter och grönsaker har vissa delade polyphenoliska föreningar, om än med olika kvantiteter, inklusive flavonoider, stilbener och fenolsyra 3 . Trots att polyfenoler ofta är förknippade med färgglada frukter och grönsaker, är detta inte helt sant. Till exempel finns zeaxanthin och xantin närvarande i grönsaker som inte är mycket färgglada, såsom lök och vitlök, som är från familjen av scallions och är förknippade med många hälsofördelar 4 . Bortsett från att de är förknippade med flera hälsofördelar 5 , tjänar polyfenoler också växter genom att skydda dem från insekter enD ultraviolett strålning 2 . Polyfenoler är vanligen förekommande i den mänskliga kosten och anses vara kraftfulla antioxidanter, eftersom de kan scavenge Reactive Oxygen Species (ROS) 6 , 7 , 8 . De har också antiinflammatoriska 9 , antimikrobiella 10 , antihypertensiva 11 och anti-cancerogena 12 , 13 egenskaper.
Epidemiologiska studier visar en invers association mellan konsumtionen av flavonoider och kardiovaskulär sjukdom (CVD) förekomst 16 , 17 och mortalitet 14 , 15 . Bär konsumeras mycket i USA och har stora mängder polyfenoler, inklusive flavonoider. Till exempel konsumtion av blackberry (BL) juice (300 ML / d) i åtta veckor signifikant minskat systoliskt blodtryck hos dyslipidemiska patienter 18 . Jeong et al. 19 rapporterade att prehypertensiva män och kvinnor som konsumerar 2,5 g svart hallon (BRB) extrakt per dag hade lägre 24 h och natt blodtryck jämfört med de som konsumerar en placebo. Hallon (RB) minskade blodtrycket samtidigt som uttrycket av superoxiddismutas (SOD) ökade i spontant hypertensiva råttor 20 . Det har nyligen visats att BL, RB och BRB minskar nivåerna av ROS och senescence inducerad av angiotensin II (Ang II) i vaskulära smala muskelceller (VSMCs) 21 . Dessutom reducerade anthocyaninfraktionen från BL-extrakten uttrycket av inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS) och inhiberade aktiviteten av kärnfaktor kappa B (NF-KB) och extracellulär signalreglerad kinas (ERK) i lipopolysackarid (LPS) -stimulerade J774-cellerRöv = "xref"> 22. BRB-extrakt minskade NF-KB-aktiveringen och cyklooxygenas 2 (COX-2) -expressionen in vitro 23 , förbättrade lipidprofilen och förhindrade ateroskleroslesionsbildning hos möss matade en fetthaltig diet 24 . Anthocyaniner, som anses vara de mest rikliga flavonoiderna i bär, modulerar det inflammatoriska svaret i LPS-stimulerade RAW 264.7-makrofager genom att minska Tumor Necrosis Factor alfa (TNF-a) -produktionen 25 och minska proliferationen och migreringen av VSMCs 26 .
Eftersom det har blivit ett växande intresse för att förstå polyphenols roll för människors hälsa och sjukdom är det viktigt att optimera extraktionsmetoden. Lösningsmedelsutvinning används allmänt för detta ändamål, eftersom det är kostnadseffektivt och enkelt reproducerbart. I denna studie användes en lösningsmedelsextraktion med etanol tillsammans med en ultraljudassisterad extraktionN-metod, som anpassades från Kim och Lee 27 . Rening och fraktionering av råa extrakt (CE) med användning av kloroform och etylacetat utfördes för erhållande av renad extrakt (PE) fraktion som anpassades från Queires et al., 28 . Vidare jämfördes effektiviteten av råa mot renade polyfenol-extrakt från BL vid reducering av basal fosforylering av ERK1 / 2, och representativa exempel på den inhiberande effekten av renat BL-polyfenol-extrakt på Ang II-inducerade signalreduktioner i VSMCs tillhandahölls.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polyfenoler isolerade från bär innehåller distinkta kompositioner. Det etanolbaserade extraktionsprotokollet som beskrivs här tillåts för identifiering av olika nivåer av fenolsyra och flavonoider närvarande i råa och renade polyfenol-extrakt av BL ( tabell 1 ). CE berikades i gallinsyra, ferulsyra, 4-0-koffeoylkinsyra och 5-0-koffeoylkinsyra. Reningsprocessen förändrade inte signifikant nivåerna av gallinsyra och p-kumarsyra. Det ökade emellertid nivåerna av 3-0- koffeoylkinsyra …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av American Heart Association (14GRNT20180028) och Florida State University Council on Research and Creativity (COFRS).
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
- Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions–a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
- Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
- Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
- Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
- Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity?. Crit Rev Food Sci Nutr. 56, S46-S59 (2016).
- Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
- Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
- Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
- Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
- Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
- Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
- Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
- Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
- Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
- Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
- Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
- Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
- Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
- Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
- Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
- Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
- Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
- Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
- Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, 2.1-2.12 (2002).
- Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
- Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
- Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).
