이 작품은 신장 GFP 유전자 변형 제브라 피쉬를 사용하여 부분적인 신장 손상의 새로운 생체 내 모델을 제시합니다. 이 모델은 신장 상피 세포의 표적 절제를 유도하여 네프론 손상 및 수리의 세포 기작을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
급성 신부전 (AKI)은 사망률이 높은 일반적인 의학적 증상입니다. 신장의 수선 능력을 통해지지 치료 후 적절한 신장 기능을 회복시키는 것이 가능합니다. 그러나 세포 죽음을 최소화하고 재생 과정을 향상시키기 위해서는 세포 수준에서 네프론 세포의 죽음과 복구가 어떻게 발생하는지 더 잘 이해해야합니다. zebrafish pronephros는 포유류 네프론과 유사한 해부학 적 세그먼트를 포함하기 때문에이 목표를 달성하는 데 적합한 모델 시스템입니다. 이전에 물고기에서 신장 손상을 연구하는 데 사용 된 가장 일반적인 모델은 약리학 적 겐타 마이신 (gentamicin) 모델이었습니다. 그러나이 모델은 손상의 정확한 시공간 조절을 허용하지 않으므로 신장 수리와 관련된 세포 및 분자 과정을 연구하기가 어렵습니다. 이 한계를 극복하기 위해이 연구는 겐타 마이신 접근법과 달리 특정 녹색 형광 단백질 (Green Fuorescent Protein, GFP) -ex네오 프론 세그먼트를 누르는 것은 보라색 레이저 빛 (405 nm)을 사용하여 광 비화 될 수 있습니다. 이 AKI의 새로운 모델은 다른 상피 손상 방법이없는 많은 이점을 제공합니다. 주요 이점은 강력한 생체 내 동물 모델 에서 부상 수준과 정확한 시공간 조절을 "다이얼"할 수있는 능력입니다. 이 새로운 방법은 신장 손상 및 복구 메커니즘에 대한 이해 수준을 크게 높일 수있는 가능성이 있습니다.
서론
급성 신부전으로도 불릴 수있는 급성 신부전 (AKI) 1 , 2 는 신장 기능의 급격한 손상으로 정의됩니다 3 . 이 상태에 대한 이해 수준은 수년에 걸쳐 현저하게 향상되었지만, 이환율과 사망률은 여전히 1 , 2로 높습니다. 약물 치료의 여러 임상 시험의 결과가 음성 인 4,5 인 경우, 이 상태에 대한 현재 치료법은 대부분지지 적입니다. 신장은 스스로 회복 할 수있는 능력이 있다는 점에서 독특합니다. 따라서 AKI의 조기 진단 후지지 치료가 이환율을 제한하는 최선의 방법입니다 6 . 그러나 AKI를 조기에 발견하기는 어렵고 투석을 필요로하는 환자의 경우 사망률이 50 ~ 80 %. 신장이 스스로 회복 할 수있는 능력과이 상태에 대한 치료 옵션이 없기 때문에이 nephron 재생 과정을 향상시키는 방법을 개발하는 것이 중요합니다.
부상과 동물 모델의 다른 에이전트를 포함 AKI 연구에....
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프로토콜
이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험실 동물의 관리와 사용에 관한 가이드의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 정형 외과 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (NYITCOM IACUC)의 NYIT 대학에서 승인되었습니다. 모든 수술과 생체 내 실험은 트리 케인 마취하에 수행되었으며 고통을 최소화하기위한 모든 노력이 이루어졌습니다.
1. 배아 확보 및 유지
- 신장 GFP 형광 zebrafish를 교차하여 배아를 얻을 수 있습니다.
참고 : 형광으로 표지 된 제브라 피쉬 트랜스 제닉 라인의 예가 표 1 에 나와 있습니다. - 수정 후 24 시간 동안 E3 솔루션에 28.5 ° C에서 배아를 유지.
- 24 시간 후, 배지를 0.003 % 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU)를 함유하는 E3 용액으로 대체한다.
참고 : 멜라닌 생성에서 티로시나제 의존성 단계를 차단하기 때문에 PTU가 사용됩니다.따라서 색소 침착을 방지합니다. 여기서,이 솔루션은 E3-PTU라고합니다. - 수정 된 배아를 28.5 ° C에서 6> dpf가 될 때까지 높이십시오. 그 ....
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결과
이 프로토콜은 ET (krt8 : EGFP) sqet11-9, ET (krt8 : EGFP) sqet33-d10 및 Tg (atp1a1a.4 : GFP)를 비롯한 많은 신장 GFP 트랜스 제닉 라인에서 성공적으로 사용되었음을 유의하십시오. 여기에 표시된 결과는 ET (krt8 : EGFP) sqet11-9 행을 사용하여 얻은 결과입니다.
그림 1 은 광 절제 프로토콜의 예를 보여줍니다. 평균 GFP 강도는 관심 영역 내부에서 모니터링됩니다 ( 그림 1A 및 영화 1 ). 평균 강도 트레이스의 예가 그림 1B 에 나와 있.......
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토론
전체 레이저 출력은 시스템마다 다릅니다. 그러나 % GFP 광 표백을 사용하면 레이저 출력의 변화와 관계없이 형광 신장에 전달 된 총 에너지를 판독 할 수 있고 노출 시간으로 보정 할 수 있습니다. 그러나이 방법에 대한 다른 조직의 반응은 다양합니다. 신장이 성숙하는 동안에도 성숙한 유충보다 젊은 배아에서 GFP 형광을 50 % 감소시키는 것이 훨씬 더 어렵습니다. 이 프로토콜을 수정하고 다른 응용 분야에 적용 할 때 광 절제에 대한 조직 반응성의 이러한 차이점을 고려해야합니다. 따라서 상해의 양과 손상된 신장 상피의 예측 된 반응을 적절히 측정하기 위해 GFP 형광의 감소율을 모니터링하는 것이 중요합니다.
이 방법의 주요 이점은 신장 손상의 다른 방법과 비교했을 때zebrafish는 그것이 부상의 시공간 위치의 정확한 제어를 허용한다는 것입니다. 또한 연구원은 부상 수준을 위 아래로 다이얼 할 수 있습니다. 부상의 양을 조절하는이 능력은 상피 세포의 반응을 검사 할 수 있어.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
신장 GFP 형질 전환 계통을 공유 한 Dr. Iain Drummond와 Vladimir Korzh 박사에게 감사드립니다. 또한 NYITCOM이이 작업을 수행하는 데 필요한 자원을 제공 한 것에 대해 감사드립니다. 이 연구의 일부는 K08DK082782, R03DK097443 (NIH) 및 HSCI Pilot Grant (AV) 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 페트리 접시, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | 절차 사용 : 2.4 단계, 2.7 |
| 페트리 접시, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | 절차 사용 : 1 단계 |
| Dechorination forceps - 전자 현미경 과학 Dumont 핀셋 5 Dumostar | Fischer | Scientific 50-241-57 | 절차 사용 : 2.1.1 |
| 단계 플라스틱 전사 피펫 | 글로브 Scientific | 135030 | 절차적 사용: 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | 절차적 사용: 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | 절차적 사용: 2.3 |
| 당겨진 유리 프로브(유리 모세관에서 수동으로 제조) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | 절차적 사용: 2.4 |
| 단계실체현미경 | 니콘 | SMZ1270 | 절차적 사용: 1.5단계 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | 절차적 사용: 1.5 |
| Eclipse C2 Plus 컨포칼 현미경 시스템 | 니콘 | 절차적 사용: 3단계 | |
| 1x E3 솔루션 | 생성에 사용되는 레시피: 5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl2, 0.33mM MgSO4 절차적 단계 사용: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | 절차적 단계 사용: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS 요소 소프트웨어 | Nikon | C2+ | 절차적 사용: 3단계 |
| 레이저 장치 | Agilent | MLC 400 | 절차적 단계 3.11 |
| Propidium 요오드화물 (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | 절차 단계 사용법 : 4.2 |
참고문헌
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Inj....
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재인쇄 및 허가
