عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة
Summary
في مهدها الخميرة هو نموذج متميز لدراسة ديناميات أنيبيب في الجسم الحي بسبب الوراثة القوية وبساطة الهيكل الخلوي أنيبيب لها. يصف بروتوكول التالية كيفية تحويل والخلايا الثقافة الخميرة، واكتساب مبائر الصور المجهري، وكميا تحليل ديناميات أنيبيب في الخلايا الحية الخميرة.
Abstract
الأنابيب الدقيقة حيوية أساسية للعديد من العمليات الخلوية، ويمكن أن قياسات دقيقة للديناميات أنيبيب توفير نظرة ثاقبة كيف تنظم خلايا هذه العمليات وكيف راثية الطفرات تنظيم تأثير. القياس الكمي لديناميات أنيبيب في نماذج متعددة الخلايا لديها عدد من التحديات المرتبطة بها، بما في ذلك الكثافة العالية أنيبيب والقيود المفروضة على التلاعب الجيني. في المقابل، فإن نموذج الخميرة في مهدها يوفر المزايا التي تغلب على هذه التحديات. يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس ديناميكية الأنابيب الدقيقة واحدة في الخلايا الحية الخميرة. يتم الالتزام الخلايا معربا عن تويولين الموسومة fluorescently إلى غرف الشريحة تجميعها، والسماح لمستقر الحصول على الصور مرور الزمن. دليل مفصل لسرعة عالية، يتم توفير الحصول على الصور رباعية الأبعاد أيضا، وكذلك بروتوكول لقياس خصائص الأنابيب الدقيقة ديناميكية في مداخن صورة مبائر. هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع علم الوراثة الخميرة التقليدية، سفر الأمثالايديس وهو نهج غير مناسبة فريدة لتقييم كمي لآثار المنظمين أنيبيب أو الطفرات التي تغير نشاط مفارز تويولين.
Introduction
الأنابيب الدقيقة هي البوليمرات هيكل الخلية مصنوعة من مفارز البروتين αβ تويولين وتستخدم في طائفة واسعة من السياقات الخلوية، بما في ذلك النقل داخل الخلايا، انقسام الخلايا، التشكل، والحركة. لبناء شبكات أنيبيب لهذه الأدوار المتنوعة، يجب أن خلايا تنظيم بعناية أين ومتى الأنابيب الدقيقة النموذج. ويتم إنجاز هذا النظام عن طريق التحكم في ردود الفعل التي إما تجميع مفارز-αβ تويولين في البوليمرات أنيبيب أو الأنابيب الدقيقة تفكيك إلى وحدات الحرة؛ هذا هو المعروف باسم ديناميات أنيبيب.
والهدف الرئيسي من حقل أنيبيب هو توضيح الآليات الجزيئية التي تنظم ديناميات أنيبيب، بما في ذلك دراسات مفارز-αβ تويولين والمنظمين خارجي أن ربط تويولين و / أو الأنابيب الدقيقة. والمنهج التجريبي راسخة هو إعادة هذا النظام في المختبر باستخدام تنقية البروتين αβ تويولين، في كثير من الأحيان في كومbination مع المنظمين خارجي النقاء. ورغم أن هذا هو نهج مفيد، فمن الواضح أن ديناميات أنيبيب في أنظمة أعيد تختلف بشدة من تلك التي لوحظت في الخلايا الحية. على سبيل المثال، الأنابيب الدقيقة تنمو بشكل أسرع وأبطأ يتقلص في الجسم الحي من في المختبر. ويمكن أن يعزى هذه الاختلافات بتوافر المعروف المنظمين خارجي 1، فضلا عن العوامل بعد، غير محددة في الخلايا. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحديد أنشطة المنظمين أنيبيب والمسوخ التي تعطل ديناميكية في سياق الخلوي الأصلي.
على الرغم من أن نماذج متعددة الخلايا وقد ثبت أن الأنظمة السائدة للتحقيق وظيفة أنيبيب وتنظيم عالي المستوى، والعديد من الاهتمامات العملية تحد بشدة من فائدة هذه نماذج لقياس دقيق للديناميات أنيبيب. أولا، عدد كبير من الأنابيب الدقيقة، التي تتراوح بين عشرات الآلاف في كل خلية، يجعل من الصعب بثقةتتبع الأنابيب الدقيقة الفردية على مر الزمن. وتتناول العديد من الدراسات هذا التحدي من خلال تصوير البروتينات التي توطين بشكل انتقائي لغايات أنيبيب، مثل البروتينات في (EB) أسرة ملزم نهاية. ومع ذلك، ومن المعروف أن هذه البروتينات في توطين فقط إلى أقاصي المتزايد الأنابيب الدقيقة في metazoans 2. ولذلك، يقتصر فائدة هذه البروتينات لقياس مباشرة معدلات النمو، في حين فقط قياس غير مباشر جوانب أخرى من ديناميكية، مثل تكرار كارثة. ثانيا، على الرغم من التقدم في التكنولوجيا التحرير الجينوم، وخلق الخلايا التي تعبر عن ثابت تويولين fluorescently المسمى أو إدخال تحولات على التعامل بشكل انتقائي تويولين أو أنيبيب المنظمين لا يزال يشكل تحديا كبيرا. وعلاوة على ذلك، فإن وجود العديد من isotypes تويولين في metazoans يفند دراسة كيفية تأثير الطفرات الجينات تويولين الفردية.
ويوفر نظام الخميرة في مهدها العديد من المزايا الهامة لقياس في الجسم الحي microtubuديناميات جنيه. الخميرة لديها شبكة أنيبيب مبسطة تسمح التصور من الأنابيب الدقيقة الفردية. في الخميرة، والأنابيب الدقيقة تنبع من تنظيم المراكز المعروفة باسم الهيئات القطب المغزل (SPBs)، والتي هي جزء لا يتجزأ في الغلاف النووي 3. وSPBs بمثابة السقالات لمجمعات للγ تويولين الصغيرة التي nucleate الأنابيب الدقيقة 4، 5. SPBs nucleate فئتين من الأنابيب الدقيقة، الأنابيب الدقيقة المغزل والأنابيب الدقيقة نجمي. ميكروتثبول المغزل مشروع في جبلة النواة ومهمة لربط إلى الكروموسومات عبر الأنابيب الدقيقة الحيز الحركي ولتحقيق الاستقرار في المغزل عبر تداخل الأنابيب الدقيقة بين القطبين 6. في المقابل، مشروع الأنابيب الدقيقة نجمي الخارج في العصارة الخلوية ونادرة نسبيا مقارنة مع شبكة كثيفة من الأنابيب الدقيقة المغزل. خلال الانقسام، وخلايا ما قبل طور الصعود ليس لها سوى 1-2 الأنابيب الدقيقة نجمي المنبثقة من أي SPB. هذه موجودة وأناالأنابيب الدقيقة ndividual بدلا من حزم 7. دور الأنابيب الدقيقة نجمي خلال الانقسام هو نقل نواة والمغزل في تقاطع بين الأم وبرعم المقصورات، والمعروفة باسم الرقبة مهدها. وتنطوي هذه الحركة مسارات واضحة المعالم التي تولد قوة على الأنابيب الدقيقة نجمي، وسحب نواة والمغزل نحو وفي نهاية المطاف إلى الرقبة برعم 8.
ميزة أخرى للنظام الخميرة هي فائدة علم الوراثة، والتي يمكن استخدامها لتحقيق المنظمين أنيبيب ومفارز تويولين بدقة لا مثيل لها. تمتلك الخميرة أيضا مرجع مبسط لisotypes تويولين: واحد-β تويولين الجين (TUB2) واثنين من الجينات ألفا تويولين (TUB1 وTUB3). الطفرات يمكن إدخال بسهولة في هذه الجينات، وبالتالي درس في عدد السكان تويولين متجانسة 9 و 10. وهناك عدد من على نطاق واسعيبني المتاحة لوضع العلامات الأنابيب الدقيقة، وهذه يمكن أن تكون موجهة لتحقيق التكامل في مواضع الكروموسومات للتعبير مستقر (انظر مناقشة).
ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو أن الأنابيب الدقيقة صورة واحدة في الخلايا الحية الخميرة في أربعة أبعاد (X، Y، Z، وT) لقياسات عالية الدقة للديناميات أنيبيب. وصفت وسائل لدمج يبني لوالتعبير على مستوى منخفض التأسيسية من تويولين fluorescently المسمى في خلايا الخميرة. قبل التصوير، هي التي شنت الخلايا الحية إلى غرف الشرائح المغلفة مع كتين كونكانافالين A لتحقيق الاستقرار في الخلايا للتصوير على المدى الطويل. المعلمات المثلى لاقتناء الصور، فضلا عن سير العمل لتحليل البيانات، وتوصف أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويقدم نموذج الخميرة في مهدها المزايا الرئيسية لجمع قياسات عالية الدقة للديناميات أنيبيب في مكان في الجسم الحي، بما في ذلك القدرة على الأنابيب الدقيقة صورة واحدة مع مرور الوقت والقدرة على التعامل مع tubulins والمنظمين أنيبيب باستخدام أدوات علم الوراثة الخميرة.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كيري بلوم (جامعة نورث كارولينا)، كيونغ لي (NCI)، ستيفن ماركوس (جامعة ولاية كولورادو)، وإلمار شيبيل (UNIVERSITAT هايدلبرغ) لتبادل مختلف البلازميدات FP-TUB1. ونحن ممتنون لميليسا غاردنر (جامعة مينيسوتا) لتدريب لنا في طريقة إعداد غرفة الشرائح. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منح R01GM112893-01A1 (لJKM) وT32GM008730 (م).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. 유전학. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. 생화학. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
