L'imagerie à haute résolution et d'analyse de l'individu Astral microtubules Dynamique dans la levure bourgeonnante
Summary
Levure bourgeonnante est un modèle avantageux pour l' étude de la dynamique des microtubules in vivo en raison de sa génétique puissante et la simplicité de son cytosquelette de microtubules. Le protocole suivant décrit comment transformer des cellules de levure et de culture, d'acquérir des images de microscopie confocale, et analyser quantitativement la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes de levure.
Abstract
microtubules dynamiques sont fondamentales pour de nombreux processus cellulaires et des mesures précises de la dynamique des microtubules peut donner un aperçu de la façon dont les cellules régulent ces processus et la façon dont la régulation de l'impact des mutations génétiques. La quantification de la dynamique des microtubules dans les modèles métazoaires a un certain nombre de défis associés, y compris une forte densité de microtubules et les limitations sur les manipulations génétiques. En revanche, le modèle de levure bourgeonnante offre des avantages qui permettent de surmonter ces défis. Ce protocole décrit un procédé pour mesurer la dynamique des microtubules simples dans des cellules vivantes de levure. Les cellules exprimant la tubuline marqués par fluorescence sont collées à des chambres à glissière assemblés, ce qui permet l'acquisition d'image stable time-lapse. Un guide détaillé pour la grande vitesse, l'acquisition d'images en quatre dimensions est également fourni, ainsi qu'un protocole pour quantifier les propriétés des microtubules dynamiques dans des piles d'images confocales. Ce procédé, associé à la génétique des levures classiques, provIdes une approche qui est particulièrement bien adapté pour évaluer quantitativement les effets des régulateurs de microtubules ou des mutations qui modifient l'activité des sous-unités de tubuline.
Introduction
Les microtubules sont des polymères cytosquelette en sous-unités protéiques aß-tubuline et sont utilisés dans une grande variété de contextes cellulaires, y compris le transport intracellulaire, la division cellulaire, la morphogenèse et la mobilité. Pour construire des réseaux de microtubules pour ces divers rôles, les cellules doivent réguler soigneusement où et quand la forme de microtubules. Cette régulation se fait en contrôlant les réactions que soit l'assemblage des sous-unités aß-tubuline en microtubules des polymères ou des microtubules démonter en sous-unités libres; ceci est connu comme la dynamique des microtubules.
Un objectif majeur de la zone de microtubule est d'élucider les mécanismes moléculaires qui régulent la dynamique des microtubules, y compris des études sur les sous-unités aß-tubuline et les régulateurs extrinsèques qui se lient à la tubuline et / ou aux microtubules. Une approche expérimentale bien établie est de reconstituer ce système in vitro en utilisant la protéine αβ-tubuline purifiée, souvent comavec les régulateurs extrinsèques binaison purifiés. Bien que ce soit une approche utile, il est clair que la dynamique des microtubules dans les systèmes fortement reconstitué diffère de celle observée dans les cellules vivantes. Par exemple, les microtubules croissent plus vite et rétrécissent plus lente in vivo que in vitro. Ces différences peuvent être attribuées à la disponibilité des régulateurs connus extrinsèques 1, ainsi que des facteurs encore à définir et dans les cellules. Par conséquent, il est essentiel de déterminer les activités des régulateurs des microtubules et des mutants qui perturbent la dynamique dans un contexte cellulaire natif.
Bien que les modèles métazoaires se sont avérés être les systèmes en vigueur pour enquêter sur la fonction des microtubules et de l'organisation d'ordre supérieur, plusieurs préoccupations pratiques limitent sérieusement l'utilité de ces modèles pour la mesure précise de la dynamique des microtubules. Tout d'abord, le nombre élevé de microtubules, allant de dizaines à des milliers par cellule, il est difficile de confiancesuivre les microtubules individuels au fil du temps. De nombreuses études abordent ce défi en imagerie des protéines qui localisent sélectivement aux extrémités microtubules, telles que les protéines de la famille contraignante fin (EB). Cependant, ces protéines sont connues pour ne localiser aux extrémités de microtubules de plus en plus métazoaires 2. Par conséquent, l'utilité de ces protéines est limitée à des taux de croissance mesurant directement, alors que la mesure indirectement d'autres aspects de la dynamique, comme la fréquence de la catastrophe. D'autre part, malgré les progrès de la technologie de montage sur le génome, la création de cellules qui expriment de manière stable marqué par fluorescence mutations tubuline ou l'introduction de manipuler sélectivement tubuline ou régulateurs microtubules reste un défi important. De plus, la présence de nombreux isotypes de tubuline dans l'étude métazoaires déconcerte de la façon dont les mutations affectent les gènes individuels de tubuline.
Le système de levure bourgeonnante offre plusieurs avantages importants pour la mesure dans microtubu vivodynamique. Le La levure a un réseau de microtubules simplifié qui permet la visualisation des microtubules individuels. Dans la levure, les microtubules émanent de l' organisation des centres appelés corps polaires broche (de), qui SPB sont incorporés dans l'enveloppe nucléaire 3. Les SPB servent échafaudages pour les petits complexes y-tubuline qui nucléée microtubules 4, 5. SPBs deux classes de nucléée microtubules, microtubules broche et microtubules astraux. Projet de broche de microtubules dans le nucléoplasme et sont importants pour la fixation à des chromosomes via microtubules kinétochoriens et pour la stabilisation de la broche par l' intermédiaire de chevauchement microtubules interpolaires 6. En revanche, le projet de microtubules astraux vers l'extérieur dans le cytosol et sont relativement rares par rapport au réseau dense de microtubules du fuseau. Au cours de la mitose, les cellules pré-anaphase ont seulement 1-2 microtubules astraux émanant de deux SPB; ceux-ci existent en tant que imicrotubules ertaines plutôt que sous forme de faisceaux 7. Le rôle des microtubules pendant la mitose astrale consiste à déplacer le noyau et la broche dans la jonction entre la mère et les compartiments bourgeon, connu sous le col du bouton. Ce mouvement implique des voies bien définies qui génèrent la force sur les microtubules astraux, en tirant le noyau et la broche en direction et , éventuellement , dans le col du bouton 8.
Un autre avantage du système de levure est l'utilité de la génétique, qui peuvent être utilisés pour étudier les organismes de réglementation des microtubules et des sous-unités de tubuline avec une précision sans précédent. La levure possède également un répertoire simplifié de tubuline isotypes: un seul gène β-tubuline (TUB2) et deux gènes d' a-tubuline (Bain1 et TUB3). Des mutations peuvent être facilement introduits dans ces gènes et , par conséquent étudié dans une population homogène de la tubuline 9, 10. Il y a un certain nombre de trèsconstructions disponibles pour microtubules d'étiquetage, et ceux-ci peuvent être ciblés pour l'intégration au locus chromosomique pour une expression stable (voir la discussion).
Le but général de cette méthode est d'images individuelles microtubules dans des cellules vivantes de levure en quatre dimensions (X, Y, Z et T) pour des mesures de haute résolution de la dynamique des microtubules. Des procédés pour l'intégration des constructions pour la constitutive, l'expression de faible niveau de tubuline marqué par fluorescence dans les cellules de levure sont décrits. Avant imagerie, les cellules vivantes sont montées dans des chambres de lame enduite avec la lectine concanavaline A pour stabiliser les cellules pour l'imagerie à long terme. Les paramètres optimaux pour l'acquisition d'images, ainsi qu'un flux de travail pour l'analyse des données, sont également décrites.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle de levure bourgeonnante offre des avantages majeurs pour la collecte des mesures de haute résolution de la dynamique des microtubules dans un cadre in vivo, y compris la capacité à image unique microtubules au fil du temps et la possibilité de manipuler tubuline et des régulateurs de microtubules en utilisant les outils de la génétique de levure.
Les chambres revêtues A concanavaline fournissent un certain nombre d'avantages par rapport aux dispositifs décrit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Kerry Bloom (Université de Caroline du Nord), Kyung Lee (NCI), Markus Steven (Colorado State University), et Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) pour le partage de différents plasmides FP-tub1. Nous sommes reconnaissants à Melissa Gardner (Université du Minnesota) pour nous former dans la méthode de préparation de la chambre de diapositives. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) accorder R01GM112893-01A1 (à JKM) et T32GM008730 (à CE).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
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