Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe
Summary
Hefe Angehende ist ein vorteilhaftes Modell die Dynamik der Mikrotubuli in vivo aufgrund seiner leistungsstarken Genetik und die Einfachheit der Mikrotubuli – Zytoskelett für das Studium. Das folgende Protokoll beschreibt, wie zu transformieren und Kultur Hefezellen, konfokale Mikroskopie Bilder erfassen und quantitativ die Dynamik der Mikrotubuli in lebenden Hefezellen analysieren.
Abstract
Dynamische Mikrotubuli sind von grundlegender Bedeutung für viele zelluläre Prozesse, und genaue Messungen der Dynamik der Mikrotubuli können Einblick, wie Zellen regulieren diese Prozesse und wie genetische Mutationen Auswirkungen Regulierung. Die Quantifizierung der Dynamik der Mikrotubuli in metazoan Modelle hat eine Reihe von Herausforderungen im Zusammenhang, einschließlich einer hohen Dichte von Mikrotubuli und Einschränkungen auf genetische Manipulationen. Im Gegensatz dazu bietet das Bäckerhefe Modell Vorteile, die diese Herausforderungen zu meistern. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, die Dynamik des einzelnen Mikrotubuli zu messen in lebenden Hefezellen. Zellen fluoreszierend markierte Tubulin exprimieren, werden zu montierten Schieber Kammer eingehalten, so dass für eine stabile Zeitraffer-Bildaufnahme. Eine ausführliche Anleitung für die Hochgeschwindigkeits, vierdimensionale Bildaufnahme wird auch als auch als ein Protokoll vorgesehen ist, um die Eigenschaften des dynamischen Mikrotubuli in konfokaler Bildstapeln zu quantifizieren. Dieses Verfahren, mit herkömmlicher Hefegenetik kombiniert, proveinen Ansatz ides, die in einzigartiger Weise geeignet ist für die quantitativ die Effekte von Mikrotubulus-Regulator oder Mutationen der Beurteilung, die die Aktivität von Tubulin-Untereinheiten zu verändern.
Introduction
Mikrotubuli sind Polymere aus Zytoskelett-αβ-Tubulin-Protein-Untereinheiten und werden in einer großen Vielzahl von zellulären Zusammenhängen, einschließlich intrazellulären Transport, die Zellteilung, die Morphogenese und Motilität verwendet. Um Mikrotubuli Netzwerke für diese unterschiedlichen Rollen zu erstellen, müssen Zellen sorgfältig regeln, wann und wo Mikrotubuli Form. Diese Regelung wird durch die Steuerung der Reaktionen erreicht, daß entweder αβ-Tubulin-Untereinheiten in Mikrotubuli-Polymere oder disassemble Mikrotubuli in freie Untereinheiten zusammenzubauen; dies wird als die Dynamik der Mikrotubuli bekannt.
Ein Hauptziel des Mikrotubuli-Feld ist, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die Dynamik der Mikrotubuli, einschließlich Studien der αβ-Tubulin-Untereinheiten und extrinsische Regulatoren regulieren, die an Tubulin und / oder an Mikrotubuli binden. Ein etablierter experimenteller Ansatz ist dieses System in vitro unter Verwendung von gereinigtem αβ-Tubulin – Protein rekonstituieren, die oft in combination mit gereinigtem extrinsischen Regulatoren. Obwohl dies ein sinnvoller Ansatz ist, ist es klar, dass in rekonstituierten Systemen die Dynamik der Mikrotubuli stark von der in lebenden Zellen beobachtet unterscheidet. Zum Beispiel wächst Mikrotubuli schneller und schrumpft langsamer in vivo als in vitro. Diese Unterschiede können auf die Verfügbarkeit von bekannten extrinsischen Regler 1 sowie auf noch-nicht definierte Faktoren in Zellen zurückgeführt werden. Daher ist es wichtig, die Aktivitäten von Mikrotubulus-Regulierungsbehörde und Mutanten zu bestimmen, die Dynamik in einem nativen zellulären Kontext zu stören.
Obwohl metazoan Modelle die vorherrschenden Systeme werden für die Untersuchung von Mikrotubuli-Funktion und höherer Ordnung Organisation, mehrere praktische Bedenken schränken den Nutzen dieser Modelle für die präzise Messung der Dynamik der Mikrotubuli bewährt haben. Erstens ist die hohe Anzahl von Mikrotubuli, die von Dutzenden bis Tausenden pro Zelle, macht es schwierig, sicherverfolgt einzelne Mikrotubuli im Laufe der Zeit. Viele Studien befassen sich diese Herausforderung durch Abbilden Proteine, die an Mikrotubuli-Enden, wie beispielsweise Proteine in der End-Bindung (EB) Familie selektiv lokalisieren. Jedoch werden diese Proteine bekannt, nur an den Enden des Wachsens Mikrotubuli in Metazoen 2 zu lokalisieren. Daher wird die Nützlichkeit dieser Proteine beschränkt auf Wachstumsraten direkt zu messen, während nur indirekt andere Aspekte der Dynamik zu messen, wie Frequenz der Katastrophe. Zweitens, trotz der Fortschritte in der Genombearbeitungstechnologie, Zellen schaffen, die fluoreszierend markierte Tubulin oder Einführung von Mutationen stabil exprimieren, selektiv Tubulin oder Mikrotubulus-Regula zu manipulieren bleibt eine große Herausforderung. Außerdem confounds die Anwesenheit von vielen Tubulin-Isotypen in metazoans die Studie, wie Mutationen Gene einzelne Tubulin auswirken.
Die Bäckerhefe System bietet mehrere wichtige Vorteile für die in – vivo – Messung microtubule Dynamik. Hefe hat ein vereinfachtes Mikrotubuli-Netzwerk, das die Visualisierung der einzelnen Mikrotubuli erlaubt. In Hefe stammen Mikrotubuli von Zentren bekannt als Spindel Polkörper (SPBs) der Organisation, die 3 in der Kernhülle eingebettet ist. Die SPBs dienen als Gerüste für γ-Tubulin kleine Komplexe , die Mikrotubuli 4, 5 nukleieren. SPBs nucleate zwei Klassen von Mikrotubuli, Spindel Mikrotubuli und astralen Mikrotubuli. Spindel Mikrotubuli Projekt in Nukleoplasma und sind wichtig für die Befestigung an Chromosomen über kinetochore Mikrotubuli und zur Stabilisierung der Spindel über überlappende inter Mikrotubuli 6. Im Gegensatz dazu, nach außen vorstehen Astral Mikrotubuli in das Cytosol und relativ selten ist mit dem dichten Netz von Mikrotubuli Spindel verglichen. Während der Mitose haben pre-Anaphase Zellen nur 1-2 Astral Mikrotubuli entweder von SPB ausgeht; diese existieren, wie ichNDIVIDUELLE Mikrotubuli anstatt als Bündel 7. Die Rolle des astralen Mikrotubuli während der Mitose ist den Kern und Spindel in die Verbindung zwischen der Mutter und Knospe Abteilen, bekannt als Keim Hals zu bewegen. Diese Bewegung beinhaltet gut definierte Wege , die Kraft , die auf astralen Mikrotubuli erzeugen, ziehen den Kern und Spindel in Richtung und schließlich in die Knospe Hals 8.
Ein weiterer Vorteil des Hefe-Systems ist das Nutzen ihrer Genetik, die verwendet werden kann Mikrotubuli Regler und Tubulin-Untereinheiten mit bisher unerreichter Genauigkeit zu untersuchen. Hefe besitzt auch ein vereinfachtes Repertoire von Tubulin – Isotypen: eine einzelne β-Tubulin – Gen (TUB2) und zwei α-Tubulin – Gene (TUB1 und TUB3). Mutationen können leicht in diese Gene eingeführt werden und damit in einer homogenen Population Tubulin 9 untersucht, 10. Es gibt eine Reihe von weitverfügbar Konstrukte zur Markierung von Mikrotubuli, und diese können für die Integration in die chromosomale Loci für eine stabile Expression ausgerichtet werden (siehe Diskussion).
Das Gesamtziel dieses Verfahrens ist, die das Bild einzelnes Mikrotubuli in lebenden Hefezellen in vier Dimensionen (X, Y, Z und T) für hochauflösende Messungen der Dynamik des Mikrotubuli. Verfahren zum Konstrukten für die konstitutive, Low-Level-Expression von fluoreszenzmarkierten Tubulin in Hefezellen Integration beschrieben. Vor der Bebilderung werden lebenden Zellen in Gleitberührung Kammern montiert mit dem Lectin Concanavalin A beschichtet ist, die Zellen für die Langzeitbilderzeugung zu stabilisieren. Die optimalen Parameter für die Bildaufnahme, sowie ein Workflow für die Datenanalyse, werden ebenfalls beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bäckerhefe Modell bietet große Vorteile für die in einem in – vivo – Einstellung hochauflösende Messungen der Dynamik der Mikrotubuli sammeln, einschließlich der Fähigkeit, einzelne Bild Mikrotubuli über die Zeit und die Fähigkeit , Tubulinen und Mikrotubuli Regulatoren mit den Werkzeugen der Hefegenetik zu manipulieren.
Die Concanavalin A-beschichtete Kammern bieten eine Reihe von Vorteilen gegenüber den zuvor beschriebenen Vorrichtungen, einschließlich der g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University), und Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) für verschiedene FP-TUB1 Plasmide zu teilen. Wir sind dankbar, dass Melissa Gardner (University of Minnesota) für die Ausbildung uns in der Schieberkammer Herstellungsverfahren. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) gewähren R01GM112893-01A1 (bis JKM) und T32GM008730 (CE) unterstützt.
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
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