효모 신진 인해 강력한 유전학과 미세 소관 세포 골격의 단순함에 생체 내 미세 소관 역학 연구를위한 유리한 모델입니다. 다음 프로토콜 변환 및 문화 효모 세포, 공 초점 현미경 이미지를 수집하고, 정량적으로 효모 살아있는 세포에서 미세 소관 역학을 분석하는 방법에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
동적 미세 소관은 많은 세포 과정의 기초이며, 미세 소관 역학의 정확한 측정은 세포가 이러한 과정을 조절하는 방법에 대한 방법과 유전자 돌연변이에 미치는 영향 규정 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 후생 동물 모델에서 미세 소관 역학의 정량화는 유전자 조작에 높은 미세 소관 밀도 및 제한 사항을 포함하여 관련 문제의 번호가 있습니다. 반면, 신진 효모 모델은 이러한 문제를 극복 이점을 제공한다. 이 프로토콜은 효모 살아있는 세포에서 단일 미세 소관의 역학을 측정하는 방법을 설명합니다. 형광 태그 튜 불린을 발현하는 세포는 안정한 저속 화상 획득을 가능하게 조립 슬라이드 챔버에 부착되어있다. 고속 대한 상세한 가이드의 4 차원 이미지 획득은 공 초점 화상 스택 동적 미세 소관의 속성을 정량화하는 프로토콜뿐만 아니라, 제공된다. 이 방법은, 종래의 효모 유전자와 결합 잠정량적 튜 불린 소단위의 활성을 변경하는 레귤레이터 미세 소관 또는 돌연변이의 영향을 평가하기위한 유일하게 적합한 접근법을 IDES.
서론
미세 소관은 αβ-tubulin의 단백질 서브 유니트로 이루어지는 골격 중합체이며, 세포 내 운반, 세포 분열, 형태 형성 및 세포 운동성 포함 콘텍스트의 다양한 사용된다. 언제 어디서 미세 소관 양식이 다양한 역할에 대한 미세 소관 네트워크를 구축하기 위해 세포는 신중하게 조절해야합니다. 이 규정은 무료 하부 단위로 미세 소관 폴리머 또는 분해 미세 소관에 αβ-tubulin의 서브 유닛을 조립하거나하는 반응을 제어하여 수행됩니다; 이것은 미세 소관 역학로 알려져 있습니다.
미세 소관 분야의 주요 목표는 튜 불린 및 / 또는 미세 소관에 결합하는 αβ-tubulin의 서브 유닛 및 외부 규제 기관의 연구를 포함하여 미세 소관 역학을 조절하는 분자 메커니즘을 규명하는 것입니다. 잘 확립 된 실험 방법은 COM 종종 정제 αβ-tubulin의 단백질을 사용하여 시험 관내에서 이러한 시스템을 재구성하는정제 된 외부 레귤레이터 환 경의. 이 유용한 방법이지만, 재구성 된 시스템의 미세 소관의 역 동성이 살아있는 세포에서 관찰 된 것과 크게 다른 것은 분명하다. 예를 들어, 미세 소관은 빠르게 성장하고 체외에 비해 생체 내에서 느리게 수축. 이러한 차이는 세포의 알려진 외부 조절기
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프로토콜
1. 준비 -LEU 드롭 아웃 플레이트
- 2 L 플라스크를 멸균 증류수 800 ㎖ (다이 하이드로 O 2)를 추가한다. 강하베이스 (DOB) 분말 26.71 g, CSM-레우 0.69 g 및 한천 20 g을 추가한다. 자기 교반 막대로 섞는다. 다이 하이드로 2 O. 1 L로 가져 오기
- 121 ℃의 오토 클레이브에서 30 분 동안 19 PSI.
- 오토 클레이브에서 플라스크를 제거하고 부드러운 교반 ~ 65 ° C로 냉각 할 수 있습니다.
- 100mm 직경의 판으로 30 ㎖ / 플레이트를 붓는다. 이 4 ℃에서 저장하기 전에 36 ~ 48 시간 동안 실온에서 앉아 보자.
2. GFP - 라벨 튜 불린의 구성 적 표현 GFP-Tub1 통합
- 3 분 동안 10 ㎎ / ㎖의 단일 가닥 DNA (ssDNA를)의 스톡 농도를 끓인다.
- 정제 된 GFP-Tub1 플라스미드 DNA (11)의 400 NG 삶은 ssDNA를 2 μL의 결합.
주 : 안정, 형광 라벨에 사용할 수있는 플라스미드에는 여러 가지가 있습니다대안 형광 및 선택 마커를 이용하여 ....
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결과
효모 살아있는 세포에서 미세 소관의 역학을 측정하는 것은 미세 소관 규제 또는 튜 불린를 코딩하는 유전자의 돌연변이가 영향을 중합 및 해중합 속도뿐만 아니라, 이러한 상태 간의 전환의 주파수를 소단위 방법을 평가하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 그림 1 표시 야생형 세포에서 별 미세 소관 역학의 시간 시리즈 (430Δ tub2-) β-tubulin에 돌연변이와 돌연변이 세포. 미세 소관은 미세 소관의 길이를 시각화하는 GFP - 태그 α-tubulin에 함께 표시되어 있습니다. 빨간 화살표는 각 화상 (Figure1A 1 C)의 별 미세 소관의 길이를 추적. 미세 소관의 길이가 8 분 동안 각각의 시간 지점에서 측정하고,이 길이는 컴파일 수명 플롯 (도 1b 및 1 D)에 도시되어있다. 이 데이터는 중.......
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토론
신진 효모 모델은 시간이 지남에 이미지 하나의 미세 소관의 능력과 효모 유전학의 도구를 사용하여 tubulin의와 미세 소관 규제를 조작 할 수있는 기능을 포함하여, 생체 내 환경에서 미세 소관 역학의 고해상도 측정을 수집하기위한 주요 이점을 제공한다.
콘 카나 발린 A-코팅 챔버 용융 아가 패드를 포함하여 전술 한 장치들상에서 다수의 이점을 제공한다. 챔버와 슬라이드 미리 만들어 장기 보관하거나 즉시 사용 가능 할 수있다. 또한 콘 카나 발린 A-코팅 챔버는 세포가 원래 배양 된 동일한 매체> 6 시간 동안 효모 세포를 배양 할 수있다. 챔버 내의 세포의 수는 챔버 이미지를 만들 수있는 기간을 지시한다는 것을 명심해야한다. 코팅 챔버는 효모 세포의 단일 층 커버 슬립에 부착되도록. 마지막으로, 여러 개의 챔버를 만드는 것은 가능여러 가지 다른 효모 균주는 같은 슬라이드에 몇 군데 있습니다.
상대적으로 .......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
우리는 다양한 FP-TUB1 플라스미드를 공유 케리 블룸 (노스 캐롤라이나 대학), 켱 리 (NCI), 스티븐 마르쿠스 (콜로라도 주립 대학), 그리고 엘마 쉬에벨 (Universität 하이델베르크를) 감사합니다. 우리는 슬라이드 챔버의 제조 방법에서 우리를 훈련에 대한 멜리사 가드너 (미네소타 대학)에 감사하고 있습니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) (JKM에) R01GM112893-01A1과 (CE에) T32GM008730을 부여에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DOB (dropout bases) | 일출 과학 | 1650 | |
| CSM-Leu | 선라이즈 과학 | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100 mm 폴리스티렌 플레이트 | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) 멸균 DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | DiH2O에서 10mg/mL로 재현탁합니다. 부분 표본을 -20 º에 저장하십시오. C |
| 합성 완전 매체 | 일출 과학 | 1459-100 | |
| 콘카나발린 A | 시그마-알드리치 | L7647 | DiH2O에서 2mg/mL로 재현탁합니다. 부분 표본을 -20 º에 저장하십시오. C |
| 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| 현미경 커버 슬립 | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| 파라 필름 | Fisher Scientific | 13-374-12 | 파라핀 필름 |
| VALAP (바셀린, 라놀린 및 파라핀의 동일한 부분) | 은 75 º에서 용융됩니다. C 사용 전 | ||
| 집게 | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| 포예틸렌 글리콜 (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Optics | |||
| Ti E 반전 퍼펙트 포커스 현미경 | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| 피에조 전기 스테이지 | Physik Instrumente | P-736 | |
| 회전 디스크 스캐너 | Yokogawa | CSU10 | |
| 레이저 콤바이너 모듈 | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD 카메라 | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | >카탈로그 번호 | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB 소프트웨어 | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer 플러그인 | 개방형 현미경 환경 | ||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | 참조: Song, S. and Lee, K. S. 사이토키네시스에서 Saccharomyces cerevisiae CDC5의 새로운 기능. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001년) |
참고문헌
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic beha....
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재인쇄 및 허가
