Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast
Summary
Budding levedura é um modelo vantajoso para o estudo da dinâmica dos microtúbulos in vivo, devido às suas poderosas da genética e a simplicidade do seu citoesqueleto de microtúbulos. O protocolo a seguir descreve como transformar e cultura de células de levedura, adquirir imagens de microscopia confocal, e quantitativamente analisar a dinâmica dos microtúbulos em células de levedura viva.
Abstract
microtúbulos dinâmicos são fundamentais para muitos processos celulares, e medições precisas de dinâmica dos microtúbulos pode fornecer insights sobre como as células regulam esses processos e como genética mutações regulação impacto. A quantificação da dinâmica dos microtúbulos em modelos metazoários tem um número de desafios associados, incluindo uma densidade elevada de microtúbulos e limitações em manipulações genéticas. Em contraste, o modelo de levedura de brotamento oferece vantagens que superam esses desafios. Este protocolo descreve um método para medir a dinâmica dos microtúbulos individuais em células de levedura viva. As células que expressam a tubulina fluorescente etiquetado são aderidas às câmaras de deslizamento montados, permitindo a aquisição de imagem em tempo desfasado estável. Um guia detalhado para a alta velocidade, a aquisição de imagem de quatro dimensões também é fornecido, assim como um protocolo para quantificar as propriedades dinâmicas de microtúbulos em pilhas de imagens confocais. Este método, em combinação com levedura genética convencionais, provIdes uma abordagem que é singularmente adequado para quantitativamente avaliar os efeitos reguladores de microtúbulos ou mutações que alteram a actividade de subunidades de tubulina.
Introduction
Os microtúbulos são polímeros feitos do citoesqueleto de subunidades de proteína αβ-tubulina e são utilizados numa grande variedade de contextos celulares, incluindo o transporte intracelular, a divisão celular, a morfogénese e a motilidade. Para construir redes de microtúbulos para essas funções diversas, as células devem cuidadosamente regulam onde e quando forma microtúbulos. Esta regulação é conseguida por controlo das reacções que quer montar subunidades αβ-tubulina em microtúbulos ou polímeros microtúbulos desmontar em subunidades livres; isso é conhecido como dinâmica dos microtúbulos.
Um objectivo principal do campo de microtúbulos é elucidar os mecanismos moleculares que regulam a dinâmica dos microtúbulos, incluindo estudos das subunidades αβ-tubulina e reguladores extrínsecos que se ligam a tubulina e / ou aos microtulos. Uma abordagem experimental bem estabelecido é a reconstituir este sistema in vitro utilizando a proteína αβ-tubulina purificada, muitas vezes em COMbinação com reguladores extrínsecos purificadas. Embora esta seja uma abordagem útil, é claro que a dinâmica dos microtúbulos em sistemas reconstituídos difere fortemente da observada em células vivas. Por exemplo, os microtúbulos crescem mais rapidamente e encolher mais lenta in vivo que in vitro. Estas diferenças podem ser atribuídas à disponibilidade de reguladores extrínsecos conhecidos 1, bem como a factores ainda indefinido em células. Portanto, é crítico para determinar as actividades dos reguladores de microtúbulos e mutantes que perturbam dinâmica num contexto celular nativo.
Embora os modelos metazoários provaram ser os sistemas vigentes para investigar a função dos microtúbulos e organização de ordem superior, várias preocupações práticas limitar severamente a utilidade destes modelos para a medição precisa da dinâmica dos microtúbulos. Primeiro, o elevado número de microtúbulos, variando de dezenas de milhares por célula, torna difícil a confiançarastrear microtúbulos individuais ao longo do tempo. Muitos estudos de responder a este desafio por imagiologia de proteínas que se localizam selectivamente para as extremidades dos microtúbulos, tais como as proteínas da família de ligao final (EB). No entanto, estas proteínas são conhecidos para localizar apenas às extremidades de crescimento de microtúbulos em metazoários 2. Portanto, a utilidade destas proteínas é limitado para medir directamente as taxas de crescimento, ao passo que apenas indirectamente medindo outros aspectos da dinâmica, tal como a frequência de catástrofe. Em segundo lugar, apesar dos avanços na tecnologia de edição genoma, a criação de células que expressam de forma estável tubulina marcado por fluorescência ou a introdução de mutações de manipular selectivamente tubulina ou reguladores de microtúbulos permanece um desafio significativo. Além disso, a presença de diversos isotipos de tubulina em metazoários confunde o estudo de como os genes da tubulina mutações impacto individuais.
O sistema de levedura de germinação oferece várias vantagens importantes para a medição em microtubu vivole dinâmica. Levedura tem uma rede de microtúbulos simplificada que permite a visualização de microtúbulos individuais. Em levedura, os microtúbulos emanam de organizar centros conhecidos como fusos corpos pólo (SPBs), que são incorporados no envelope nuclear 3. Os SPBs servir como suportes para pequenos complexos y-tubulina que nucleada microtúbulos 4, 5. SPBs núcleos duas classes de microtúbulos, os microtúbulos do fuso e microtúbulos astrais. Projecto microtúbulos do fuso para o nucleoplasma e são importantes para a fixação de cromossomas através de microtúbulos cinetocoro e para a estabilização do fuso através de sobreposição de microtúbulos interpolares 6. Em contraste, os microtúbulos astrais projecto para o exterior para o citosol e são relativamente raros em comparação com a densa rede de microtúbulos de fuso. Durante a mitose, as células pré-anafase têm apenas 1-2 microtúbulos astrais que emanam a partir de qualquer SPB; estes existir como imicrotúbulos ndividual e não como feixes 7. O papel de microtúbulos astrais durante a mitose é mover o núcleo e o eixo em junção entre a mãe e bud compartimentos, conhecidos como o pescoço broto. Este movimento envolve vias bem definidas que geram força sobre microtúbulos astrais, que puxam o núcleo e para a fuso e, eventualmente, para o botão 8 pescoço.
Outra vantagem do sistema de levedura é a utilidade da sua genética, que podem ser utilizados para investigar os reguladores de microtúbulos e subunidades de tubulina com precisão sem paralelo. A levedura também possuir um repertório simplificado de isotipos de tubulina: um único β-tubulina gene (TUB2) e dois genes alfa-tubulina (TUB1 e tub3). As mutações podem ser facilmente introduzidos nestes genes e, assim, estudado em uma população de tubulina homogénea 9, 10. Há uma série de amplamenteconstrues disponíveis para microtúbulos de rotulagem, e estes podem ser alvo para a integração cromossómica em loci para a expressão estável (ver a discussão).
O objectivo global do presente método é a imagem individuais microtúbulos em células de levedura vivendo em quatro dimensões (X, Y, Z, e t) para medições de alta resolução de dinâmica dos microtúbulos. Os métodos para a integração de construções para a expressão constitutiva de baixo nível de tubulina marcado com fluorescência em células de levedura são descritos. Antes da imagiologia, as células vivas são montados em câmaras inclinadas revestidos com a lectina Concanavalina A para estabilizar as células para imagiologia de longo prazo. Os parâmetros óptimos para a aquisição de imagem, bem como um fluxo de trabalho para a análise de dados, também são descritos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo de levedura de germinação oferece grandes vantagens para a recolha de medições de alta resolução de dinâmica dos microtúbulos num cenário in vivo, incluindo a capacidade de imagem microtúbulos individuais ao longo do tempo e a capacidade de manipular tubulinas e reguladores de microtúbulos, utilizando as ferramentas de genética de leveduras.
As câmaras de Concanavalina A-revestimento proporciona um número de vantagens sobre os dispositivos anteriormente descri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Kerry Bloom (Universidade da Carolina do Norte), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University), e Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) para a partilha de vários plasmídeos FP-TUB1. Somos gratos a Melissa Gardner (University of Minnesota) para nós treinando no método de preparação câmara de slide. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) conceder R01GM112893-01A1 (a JKM) e T32GM008730 (a CE).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. 유전학. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. 생화학. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
