Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах
Summary
Баддинги дрожжей является выгодной моделью для изучения динамики микротрубочек в естественных условиях из – за свою мощную генетику и простоту его микротрубочки цитоскелета. Следующий протокол описывает, как преобразовать и культуру дрожжевых клеток, приобретают конфокальной микроскопии изображений и количественного анализа динамики микротрубочек в живых дрожжевых клеток.
Abstract
Динамические микротрубочки являются основой для многих клеточных процессов, а также точные измерения динамики микротрубочек могут дать представление о том, как клетки регулируют эти процессы и как генетические мутации регулирования воздействия. Количественные динамики микротрубочек в многоклеточных моделях имеют целый ряд связанные с этим проблемами, в том числе с высокой плотностью микротрубочек и ограничения на генетических манипуляциях. В отличие от этого, начинающая модель дрожжей обеспечивает преимущества, которые позволяют преодолеть эти трудности. Этот протокол описывает метод измерения динамики одиночных микротрубочек в живых дрожжевых клеток. Клетки, экспрессирующие флуоресцентно меченый тубулин приклеивают к собранным камерам скольжения, что позволяет для стабильного получения изображения в заданном промежутке времени. Подробное руководство для высокоскоростных, приобретение четырехмерного изображения также обеспечивается, а также в качестве протокола для количественной оценки свойств динамических микротрубочек в конфокальной стеке изображения. Этот метод, в сочетании с обычной дрожжевой генетикой, прыIDES подход, который уникально подходит для количественного оценки влияния регуляторов микротрубочек или мутаций, которые изменяют активность тубулина субъединиц.
Introduction
Микротрубочки цитоскелета полимеры, изготовленные из ар-тубулина белковых субъединиц и используются в самых разнообразных клеточных контекстах, в том числе внутриклеточного транспорта, деление клеток, морфогенез и моторики. Для построения микротрубочек сетей для этих разнообразных ролей, клетки должны тщательно регулировать, где и когда микротрубочки формы. Это регулирование осуществляется путем регулирования реакции, которые либо собрать ар-тубулин микротрубочек субъединиц в полимеры или разбирать микротрубочки в свободные субъединицы; это известно как динамики микротрубочек.
Основная цель поля микротрубочек является выяснение молекулярных механизмов, которые регулируют динамику микротрубочек, в том числе исследования в ае-тубулина подразделений и внешних регуляторов, которые связываются с тубулина и / или микротрубочек. Хорошо установленный экспериментальный подход является воссоздать эту систему в пробирке с использованием очищенного тубулина-аром белка, часто в комание с очищенными внешними регуляторами. Несмотря на то, что это полезный подход, очевидно, что динамика микротрубочек в реконструированных системах сильно отличается от наблюдаемой в живых клетках. Например, микротрубочки растут быстрее и медленнее сокращаться в естественных условиях , чем в пробирке. Эти различия могут быть отнесены к доступности известных внешних регуляторов 1, а также пока-неопределенных факторов в клетках. Поэтому крайне важно, чтобы определить деятельность регуляторов микротрубочек и мутантов, которые нарушают динамику нативную сотовой связи.
Хотя многоклеточных модели оказались преобладающими системами для исследования функции микротрубочек и организаций высшего порядка, несколько практических проблем серьезно ограничивают полезность этих моделей для точного измерения динамики микротрубочек. Во-первых, большое число микротрубочек, начиная от десятков до тысяч на клетку, затрудняет уверенноотслеживать отдельные микротрубочки в течение долгого времени. Во многих исследованиях решить эту проблему с помощью визуализации белков, которые селективно локализовать с микротрубочками концов, такие как белки в семействе конечного связывания (EB). Тем не менее, эти белки , как известно, только локализовать на концах растущих микротрубочек в многоклеточных 2. Таким образом, полезность этих белков ограничивается непосредственным измерением темпов роста, в то время как только косвенно измерения других аспектов динамики, такие как частота катастрофы. Во-вторых, несмотря на успехи в редактирования генома технологии, создание клеток, которые стабильно экспрессируют флуоресцентно меченого тубулина или введения мутации избирательно манипулировать тубулина микротрубочек или регуляторов остается серьезной проблемой. Кроме того, наличие многих тубулина изотипов в многоклеточных путает исследование того, как мутации влияют на отдельные гены тубулина.
Почкованием система дрожжей обеспечивает несколько важных преимуществ для измерения в естественных условиях microtubuДинамика ля. Дрожжи имеет упрощенные микротрубочки сеть, которая позволяет визуализировать отдельные микротрубочки. В дрожжах, микротрубочки исходят из организации центров , известные как веретена полюсных тел (SPBS), которые встроены в ядерной оболочке 3. В SPBS служит в качестве каркасов для гаммы-тубулина небольших комплексов , которые пузырьковых микротрубочкой 4, 5. SPBS зарождаются два класса микротрубочек, микротрубочки веретена и астральных микротрубочек. Шпиндельные микротрубочки проект в нуклеоплазму и имеет важное значение для крепления к хромосомам с помощью кинетохорных микротрубочек и для стабилизации шпинделя с помощью перекрывающегося межполюснома микротрубочки 6. В противоположность этому, астральные микротрубочки проект наружу в цитозоле и относительно редко по сравнению с плотной сетью микротрубочек веретена. Во время митоза, предварительно анафаза клетка имеет только 1-2 астральных микротрубочки, исходящие от любого SPB; они существуют, как яndividual микротрубочки , а не как пучки 7. Ролью астральных микротрубочек во время митоза является перемещение ядра и шпинделя в стык между матерью и бутоном отсеками, известными как бутон шея. Это движение предполагает четко определенные пути , которые генерируют силы на астральных микротрубочках, натягивая ядро и шпиндель в направлении и в конечном счете в шейку почки 8.
Еще одним преимуществом системы дрожжей является полезность его генетики, которые могут быть использованы для исследования регуляторов микротрубочек и тубулина субъединицы с беспрецедентной точностью. Дрожжи также обладают упрощенным репертуаром тубулина изотипов: один β-тубулином гена (TUB2) и два альфа-тубулином генов (TUB1 и TUB3). Мутации могут быть легко введены в эти гены , и , таким образом , исследовались в гомогенной популяции тубулина 9, 10. Есть целый ряд широкоимеющиеся конструкции для маркировки микротрубочек, и они могут быть направлены на интеграцию в хромосомных локусах для стабильной экспрессии (см Обсуждения).
Общая цель этого метода состоит в изображения одиночных микротрубочек в живых дрожжевых клеток в четырех измерениях (X, Y, Z и T) для измерений с высокой разрешающей способностью динамики микротрубочек. Способы интеграции конструкций для конститутивной, низкого уровня экспрессии флуоресцентно-меченного тубулина в клетках дрожжей описаны. До начала обработки изображений, живые клетки смонтированы в слайде-камеры, покрытых лектин Конканавалин A, чтобы стабилизировать клетки для долгосрочной визуализации. Оптимальные параметры для получения изображения, а также рабочий процесс для анализа данных, также описаны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Почкование модель дрожжей предлагает значительные преимущества для сбора измерений с высоким разрешением динамики микротрубочек в обстановке в естественных условиях, в том числе способности к изображению одиночным микротрубочкам с течением времени и способностью манипулиров?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Керри Блум (Университет Северной Каролины), Кайунг Ли (NCI), Стивен Маркус (Colorado State University) и Эльмар Шибел (Universität Heidelberg) для совместного использования различных FP-TUB1 плазмид. Мы благодарны Мелисса Гарднер (Университет Миннесоты) для обучения нас в способе подготовки слайд-камеры. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (NIH) грант R01GM112893-01A1 (до Jkm) и T32GM008730 (до н.э.).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. 유전학. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. 생화학. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
