Högupplöst avbildning och analys av enskilda Astral mikrotubuli Dynamics i knoppande jäst
Summary
Knoppande jäst är en fördelaktig modell för att studera mikrotubuli dynamik in vivo på grund av dess kraftfulla genetik och enkelheten i dess mikrotubuluscytoskelettet. Följande protokoll beskriver hur man förvandlar och kultur jästceller, förvärva konfokalmikroskopi bilder och kvantitativt analysera mikrotubuli dynamik i levande jästceller.
Abstract
Dynamiska mikrotubuli är grundläggande för många cellulära processer, och noggranna mätningar av mikrotubuli dynamik kan ge insikt i hur celler reglerar dessa processer och hur genetiska mutationer slagreglering. Kvantifiering av mikrotubuli dynamik i metazoiska modeller har ett antal associerade utmaningar, inklusive en hög mikrotubuli täthet och begränsningar på genetiska manipulationer. Däremot erbjuder den spirande jästen modell fördelar som övervinner dessa utmaningar. Detta protokoll beskriver en metod för att mäta dynamiken i enstaka mikrotubuli i levande jästceller. Celler som uttrycker fluorescensmärkta tubulin följs monterade glidkamrar, vilket möjliggör stabil tidsförlopp bild förvärv. En detaljerad guide för höghastighets, är fyrdimensionell bild förvärv tillhandahålls också, såväl som ett protokoll för att kvantifiera egenskaperna hos dynamiska mikrotubuli i konfokala bildstaplar. Denna metod, i kombination med konventionella jästgenetik, provIdes ett tillvägagångssätt som är unikt lämpad för kvantitativ bedömning av effekterna av mikrotubuli regulatorer eller mutationer som förändrar aktiviteten av tubulin subenheter.
Introduction
Mikrotubuli är cytoskelettala polymerer tillverkade av ap-tubulin proteinsubenheter och används i ett stort antal olika cellulära kontexter, inklusive intracellulär transport, celldelning, morfogenes, och motilitet. Att bygga mikrotubuli nätverk för dessa olika roller, måste cellerna noggrant reglerar var och när mikrotubuli formulär. Denna reglering åstadkoms genom reglering av de reaktioner som antingen montera ap-tubulin-subenheter till mikrotubuli polymerer eller ta isär mikrotubuli till fria subenheter; detta är känt som mikrotubuli dynamik.
Ett viktigt mål för mikrotubuli fältet är att belysa de molekylära mekanismer som reglerar mikrotubuli dynamik, inklusive studier av ap-tubulin-subenheter och yttre regulatorer som binder till tubulin och / eller till mikrotubuli. En väletablerad experimentell metod är att rekonstituera detta system in vitro med användning av renat αβ-tubulin protein, ofta i comkombination med renade yttre regulatorer. Även om detta är en användbar metod, är det uppenbart att mikrotubuli dynamik i rekonstituerade system skiljer sig kraftigt från vad som observerats i levande celler. Till exempel mikrotubuli växa snabbare och krymper långsammare in vivo än in vitro. Dessa skillnader kan tillskrivas tillgängligheten av kända extrinsiska regulatorer 1, såväl som till ännu-odefinierade faktorer i celler. Därför är det viktigt att bestämma verksamheten i mikrotubuli regulatorer och mutanter som stör dynamiken i en infödd cellulär sammanhang.
Även flercelliga modeller har visat sig vara rådande system för att undersöka mikrotubuli funktion och högre ordningens organisation, flera praktiska bekymmer allvarligt begränsar användbarheten av dessa modeller för exakt mätning av mikrotubuli dynamik. Först det stora antalet mikrotubuli, allt från tiotals till tusentals per cell, gör det svårt att tryggtspåra enskilda mikrotubuli över tiden. Många studier itu med denna utmaning genom avbildning proteiner som selektivt lokaliseras till mikrotubulus ändar, såsom proteiner i slut bindning (EB) familjen. Emellertid är dessa proteiner kända för att endast lokalisera till ändarna på växande mikrotubuli i metazoans 2. Därför är användbarheten av dessa proteiner begränsade till direkt mätning av tillväxthastigheter, medan endast indirekt mätning av andra aspekter av dynamik, såsom frekvens av katastrof. För det andra, trots framsteg inom genomet redigering teknik skapar celler som stabilt uttrycker fluorescent märkt tubulin eller införa mutationer för att selektivt manipulera tubulin eller mikrotubuli regulatorer är fortfarande en stor utmaning. Dessutom förekomsten av många tubulin isotyper i metazoans blandar ihop studiet av hur mutationer påverkar enskilda tubulin gener.
Den spirande jästen systemet tillhandahåller flera viktiga fördelar för mätning in vivo microtubule dynamik. Jäst har en förenklad mikrotubuli nätverk som tillåter visualisering av enskilda mikrotubuli. I jäst, mikrotubuli emanerar från att organisera centra kända som kämspolepolkroppar (SPBs), som är inbäddade i kärnhöljet 3. De SPBs tjänar som ställningar för y-tubulin små komplex som kärnor mikrotubuli 4, 5. SPBs kärnor två klasser av mikrotubuli, spindel mikrotubuli och astrala mikrotubuli. Spindel mikrotubuli projekt i nukleoplasman och är viktiga för att fästa till kromosomer via kinetokoren mikrotubuli och för att stabilisera spindeln via överlappande mellanrummet mikrotubuli 6. I kontrast, astrala mikrotubuli projektet utåt in i cytosolen och är relativt sällsynt jämfört med tätt nätverk av spindel mikrotubuli. Under mitos, pre-Anafasa celler har bara 1-2 astrala mikrotubuli som utgår från antingen SPB; sådana finns som jagndividual mikrotubuli snarare än som buntar 7. Rollen av astrala mikrotubuli under mitos är att flytta kärnan och spindeln i övergången mellan mor och knopp fack, kända som knoppen hals. Denna rörelse medför väldefinierade vägar som genererar kraft astrala mikrotubuli, dra kärnan och spindeln mot och så småningom in i knoppen halsen 8.
En annan fördel med jästsystemet är användbarheten av dess genetik, som kan användas för att undersöka mikrotubuli regulatorer och tubulin-subenheter med oöverträffad precision. Jäst besitter också en förenklad repertoar av tubulin isotyper: en enda β-tubulin-genen (TUB2) och två a-tubulin-gener (TUB1 och TUB3). Mutationer kan lätt införas i dessa gener och därigenom studeras i en homogen tubulin population 9, 10. Det finns ett antal allmänttillgängliga konstruktioner för märkning av mikrotubuli, och dessa kan riktas för integration vid kromosom loci för stabil uttryck (se diskussion).
Det övergripande målet med denna metod är att bildenkel mikrotubuli i levande jästceller i fyra dimensioner (X, Y, Z, och T) för högupplösta mätningar av mikrotubuli dynamik. Metoder för att integrera konstruktioner för den konstitutiva, låg nivå uttryck av fluorescensmärkt tubulin i jästceller beskrivs. Före avbildning, är levande celler monterade i glidkamrar belagda med lektinet Concanavalin A för att stabilisera cellerna för långsiktig avbildning. De optimala parametrarna för bildupptagning, samt ett arbetsflöde för dataanalys, beskrivs också.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den spirande jäst modellen erbjuder stora fördelar för att samla högupplösta mätningar av mikrotubuli dynamik i en in vivo miljö, inklusive möjligheten att avbilda enskilda mikrotubuli över tid och möjlighet att manipulera tubulins och mikrotubuli regulatorer med hjälp av verktygen i jäst genetik.
De Concanavalin A-belagda kamrar ger ett antal fördelar jämfört med tidigare beskrivna anordningarna, inklusive smält agar dynor. Glider med kamrarna kan vara pre-made och …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University), och Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) för att dela olika FP-TUB1 plasmider. Vi är tacksamma för Melissa Gardner (University of Minnesota) för utbildning oss i glidkammaren framställningsmetoden. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bevilja R01GM112893-01A1 (till JKM) och T32GM008730 (CE).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. 유전학. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. 생화학. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
