Detta protokoll beskriver en metod för att testa förmågan hos ett protein att sedimentera med filamentöst aktin (F-aktin) och, om bindning observeras, för att mäta interaktionens affinitet.
Filamentous actin (F-aktin) organisationen inom celler regleras av ett stort antal aktinbindande proteiner som kontrollerar aktin-kärnbildning, tillväxt, tvärbindning och / eller demontering. Detta protokoll beskriver en teknik – aktinsammansättning, eller pelletering, analys – för att bestämma huruvida ett protein eller en proteindomän binder F-aktin och för att mäta interaktionens affinitet ( dvs dissociationsjämviktskonstanten). I denna teknik inkuberas ett protein av intresse först med F-aktin i lösning. Därefter användes differentialcentrifugering för att sedimentera aktinfilamenten, och det pelleterade materialet analyseras med SDS-PAGE. Om proteinet av intresse binder F-aktin kommer det att sedimentera med aktinfilamenten. Produkterna av bindningsreaktionen ( dvs F-aktin och proteinet av intresse) kan kvantifieras för bestämning av interaktionens affinitet. Actinpelleteringsanalysen är en enkel teknik för bestämningOm ett protein av intresse binder F-aktin och för att bedöma hur förändringar i det proteinet, såsom ligandbindning, påverkar dess interaktion med F-aktin.
Actin är ett essentiellt cytoskeletalt protein som spelar en viktig roll i flera cellulära processer, inklusive motilitet, sammandragning, vidhäftning och morfologi 1 . Actin finns i två former: monomer globulärt aktin (G-aktin) och polymeriserat filamentöst aktin (F-aktin). Inom celler styrs F-aktinorganisationen av en stor samling proteiner som reglerar kärnbildning, tillväxt, tvärbindning och demontering av aktinfilament 2 , 3 , 4 . Men hur flera aktinbindande proteiner fungerar i samverkan för att reglera aktinätverksorganisationen är fortfarande i stor utsträckning oklart.
Mätningen av protein-protein-interaktioner är ett viktigt tillvägagångssätt för att förstå hur proteiner påverkar cellulärt beteende på den biokemiska nivån. Många olika analyser kan användas för att detektera interaktioner mellan renade proteiner.Vanliga metoder för lösliga proteiner innefattar neddragningar, fluorescenspolarisation, isotermisk titreringskalorimetri och ytplasmonresonans. Viktigt är att alla dessa analyser kräver att proteiner är lösliga och är sålunda svåra att anpassa för användning med ett polymert, trådformigt protein såsom F-aktin. Här beskriver vi en teknik – aktinsammansättning, eller pelletering, analys – för att bestämma om ett protein eller proteinområde binder F-aktin och för att mäta interaktionens affinitet.
Actinpelleteringsanalysen är en relativt enkel teknik som inte kräver specialutrustning, förutom en ultracentrifug. Alla reagenser kan göras, förutsatt kunskap om grundläggande biokemi eller inköp. När bindning till F-aktin är etablerad kan analysen användas för att mäta den uppenbara affiniteten ( dvs dissociationsjämviktskonstanten) 5 . Även när en affinitet är etablerad, är pelleteringsanalysenÄr ett användbart verktyg för att mäta hur förändringar i proteinet av intresse ( dvs. posttranslationella modifieringar, mutationer eller ligandbindning) påverkar dess interaktion med F-aktin 6 . Tekniken har begränsningar (se diskussionen ) som forskaren bör vara medveten om innan försöket görs.
Aktinsam-sedimentationsanalysen är en enkel teknik som snabbt kan avgöra om ett protein binder F-aktin. Med vissa modifieringar kan tekniken även användas för att mäta samverkans affinitet. Förutom punkter som uppkommer i protokollet ovan bör följande frågor beaktas vid utformning, genomförande och tolkning av analysen.
Protein av intresse
Färskberedt eller fruset protein kan användas i analysen. Om fruset protein används, rekommenderas det starkt att resultaten jämförs med friskt (aldrig fruset) protein för att säkerställa att frysning inte påverkar F-aktinbindning.
G-actin Källa
Många pelleteringsexperiment använder G-aktin isolerat från muskel på grund av dess relativa överflöd. Det finns tre huvudaktinisotyper i däggdjur – alfa, beta och gamma – som är anmärkningsvärt lika (> 90% sekvensidentifieringty). Ändå finns funktionella skillnader mellan isotyperna 12 , 13 . Om möjligt bör den G-aktinisotyp som används i bindningsanalysen matcha in vivo- isotypen. Om t ex ett protein uttryckt i skelettmuskler är alfa-aktin det bästa valet. Om man undersöker ett protein uttryckt i fibroblaster rekommenderas beta-aktin.
Phalloidin användning
Eftersom phalloidin binder F-aktin, kan det störa eller till och med blockera bindningen av vissa F-aktinbindande proteiner ( t ex phalloidinblock cofilin från bindning till aktinfilament) 14 . Således bör phalloidin användas med försiktighet och resultaten jämförs med icke-falloidinbehandlade prover när det är möjligt.
Hög bakgrund
Det är inte ovanligt för proteiner att sediment i frånvaro av F-aktin ( Figur 1A , inget F-aktinpelletsprovs). Höga nivåer av bakgrunds sedimentering kan emellertid maskera sannaktinsam-sedimentering och göra det svårt, om inte omöjligt, att bestämma om ett protein binder F-aktin eller för att mäta interaktionens affinitet. Att tillsätta polidicanol till reaktionsbufferten (steg 4.1) kan avsevärt minska bakgrunden och är en enkel lösning. Om det inte minskar bakgrunden kan justering av reaktionsbufferten, saltkoncentrationen och / eller inkubationstemperaturen hjälpa.
Bindningskurva
För att generera en bindningskurva är det nödvändigt att variera koncentrationen av antingen protein av intresse eller F-aktin över en serie reaktioner. I praktiken är det lättare och föredraget att bibehålla F-aktin vid en fast koncentration och att variera koncentrationen av proteinet av intresse. Underhåll av F-aktin vid en fast koncentration ( t.ex. 2 μM) i pelleteringsanalysen begränsar ospecifik fångst vid högre koncentrationer av F-aktin och förhindrarDepolymerisation vid lägre (<0,5 ^ M) koncentrationer av F-aktin. Depolymerisation kan förebyggas med användning av phalloidin, även om detta introducerar en potentiell komplicerande faktor i systemet (se steg 3.3 och senare). Underhåll av F-aktin vid en bestämd koncentration gör det också möjligt att jämföra (och normalisera) F-aktinpelleten över prover och identifiera misslyckade experiment ( dvs. där F-aktinpelleten är mycket variabel, vilket förhindrar analys över koncentrationer). Slutligen tillåter upprätthållande av F-aktin vid en fast koncentration att man bestämmer om bindningen till aktinfilamentet är kooperativ ( Figur 1C ).
Mättad bindning
Liksom i alla bindande experiment är det kritiskt att bindningen till F-aktin är mättad och att koncentrationen av protein plus F-aktinplattor ( Figur 1C ). Utan en platå är det inte möjligt att beräkna en exakt dissociationsjämviktskonstant. SåledesDet är viktigt att noggrant planera utspädningsserien som ska testas och att alltid inkludera högre proteinkoncentrationer ( dvs minst 5-10 gånger högre än den förväntade K d ).
Bindningsanalys
För att de uppmätta dissociationskonstanterna ska vara avgörande bör analysen utföras med användning av en F-aktinkoncentration som tillåter koncentrationen av bindningsställen på F-aktin för proteinet av intresse att vara mycket lägre än affiniteten. För att kontrollera om detta kriterium var uppfyllt, uppskatta koncentrationen av bindningsställen från B max . Om exempelvis [F-aktin] var 2 | im och Bmax = 0,5, så [bindningsställen] ≈ 1 | im. Kd bör vara minst 5-10 gånger större än [bindningsställen]. Om den uppmätta Kd är av samma storleksordning som [bindningsställen], är det möjligt att den observerade bindningskurvan representerar en titrering av högaffinitetsbindande siTes snarare än en sann bindande isoterm. Om detta observeras, upprepa analysen med en 10-faldig lägre F-aktinkoncentration för att mäta en exakt affinitet. För interaktioner med hög affinitet kan phalloidin-stabilisering (steg 3.3) vara nödvändigt för att uppnå en F-aktinkoncentration som är tillräckligt låg för att noggrant mäta affinitet.
Slutligen finns det grundläggande begränsningar med den sedimenteringsanalys som forskarna bör vara medvetna om när de utför och utvärderar analysen. Viktigast av allt producerar samsedimenteringsanalysen inte en sann jämviktskonstant. Produkterna av bindning ( dvs protein plus F-aktin) separeras från reaktanterna under centrifugering, varpå produkterna sedan kan dissociera för att skapa en ny jämvikt. Som ett resultat kan samsedimenteringsanalysen felaktigt beräkna eller misslyckas att detektera interaktioner med låg affinitet. Eftersom många aktinbindande proteiner har en låg ( dvs mikromolär) affinitet för F-aktin, är ett negativt resultat ( <eM> dvs ingen detekterbar bindning) i analysen betyder inte nödvändigtvis att ett protein inte binder F-aktin. Som ett alternativ är TIRF-mikroskopibaserade, enkelfilamentbindande analyser känsligare och mer exakta för bestämning av en dissociationskonstant (för recensioner på denna teknik, se referenser 15, 16 ). Trots dessa begränsningar ligger pelleteringsanalysen inom de flesta forskares hjälp och är ett effektivt verktyg för att bestämma om ett protein binder F-aktin och att mäta interaktionens affinitet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant HL127711 till AVK.
Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher Scientific | 46960 |
S100-AT3 rotor | ThermoFisher Scientific | 45585 |
Ultracentrifuge tubes – 0.2 ml | ThermoFisher Scientific | 45233 |
Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A8531 |
Polidicanol (Thesit) | Sigma | 88315 |
Phalloidin | ThermoFisher Scientific | P3457 |
Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0862 |
Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 |
Imidazole | Fisher Scientific | O3196 |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | M33 |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217 |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 3779 |
Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 |
Colloidal Blue Staining Kit | ThermoFisher Scientific | LC6025 |