Summary

Ljus Sheet-baserade fluorescensmikroskopi av levande eller fixeras och färgas<em> Tribolium castaneum</em> Embryon

Published: April 28, 2017
doi:

Summary

Avbildning av morfogenes av insektsembryon med ljus ark baserade fluorescensmikroskopi har blivit teknikens ståndpunkt. Detta protokoll beskriver och jämför tre monteringstekniker som är lämpliga för Tribolium castaneum embryon, introducerar två nya skräddarsydda transgena linjerna väl lämpade för levande avbildning, diskuterar väsentliga kvalitetskontroller och indikerar aktuella experimentella begränsningar.

Abstract

Den röda mjölbagge Tribolium castaneum har blivit en viktig insekt modellorganism i utvecklingsgenetik och evolutionär utvecklingsbiologi. Observationen av Tribolium embryon med ljus ark baserade fluorescensmikroskopi har flera fördelar jämfört med konventionell widefield och konfokal fluorescensmikroskopi. På grund av de unika egenskaperna hos en ljus ark baserad mikroskop, kan tredimensionella bilder av levande exemplar registreras med högt signal-till-brusförhållanden och signifikant reducerad fotoblekning liksom foto-toxicitet längs flera riktningar över perioder som varar flera dagar. Med mer än fyra år av metodutveckling och en kontinuerlig ökning av data, verkar tiden lämpligt att fastställa standardrutiner för användning av ljus ark teknik i Tribolium samhället samt i insekts samhället i stort. Detta protokoll beskriver tre monteringstekniker lämpliga feller olika syften, presenterar två nya skräddarsydda transgena Tribolium linjer lämpliga för långsiktig levande avbildning, föreslår fem fluorescerande färgämnen för att märka intracellulära strukturer fasta embryon och ger information om uppgifter efterbehandling för tid utvärdering av de registrerade uppgifterna. Representativa resultat koncentrera sig på långsiktig levande avbildning, optisk sektione och observationen av samma embryo längs flera riktningar. Respektive dataset tillhandahålls som en nedladdningsbar resurs. Slutligen diskuterar protokoll kvalitetskontroller för live imaging assays, aktuella begränsningar och tillämpligheten av de beskrivna förfarandena till andra insektsarter.

Detta protokoll är främst avsedd för utvecklingsbiologer som söker bildlösningar som överträffar standardlaboratorieutrustning. Det främjar den kontinuerliga försök att stänga gapet mellan de tekniskt inriktade laboratorier / samhällen, som utvecklar och förbättra microskopiera metodiskt och life science laboratorier / samhällen, som kräver 'plug-and-play' lösningar på tekniska utmaningar. Dessutom stöder ett självklart synsätt som flyttar biologiska frågor i centrum för uppmärksamheten.

Introduction

Den röda mjölbagge Tribolium castaneum, som tillhör den stora familjen av mjölmaskar (Tenebrionidae), har en lång historia inom jordbruks- och biovetenskap och är den näst bäst studerade modellen insekt modellorganism efter bananfluga Drosophila melanogaster. Under de senaste fyra decennierna, blev det en mäktig och populär insekt modellorganism i utvecklingsgenetik, i evolutionär utvecklingsbiologi och under de senaste tjugo åren, embryonala morfogenes för en rad olika skäl:

Drosophila och Tribolium båda tillhör Holometabola, men avvek ungefär 300 miljoner år sedan 1, 2, 3, 4. Medan den embryonala utvecklingen av Drosophila anses allmänt som mycket härstammar visar Tribolium mer fäderneärvda sätt develling som finns i en betydligt större andel av insektsarter 5, 6, 7, 8, 9. För det första, Tribolium uppvisar icke-inrullade huvud utveckling, dvs dess mundelar och antenner uppstår redan under embryogenes 10, 11, 12, 13, 14, 15. För det andra, Tribolium följer principerna för kortgroddar utveckling, dvs abdominala segmenten tillsätts i tur och ordning från en bakre tillväxtzonen under germband töjning 16, 17, 18, 19. För det tredje utvecklar Tribolium och senare bryts nedtvå extra-embryonala membranen dvs amnion, som täcker embryot endast ventralt, och serosa, vilket omsluter embryot helt 20, 21, 22. Båda membranen spelar en avgörande morfogenetiska 23 liksom skyddande roll mot mikroorganismer 24, 25 och uttorkning 26. För det fjärde, de embryonal utveckling benen är fullt fungerande under larvstadiet och fungera som primordia för vuxna ben under PUPP metamorfos 27, 28, 29, 30, 31.

På grund av sin ringa storlek och blygsamma krav, är odling av Tribolium i laboratoriet ganska enkelt. Kulturer av vildtyp (WT) stammar eller transgena linjerna består typiskt av omkring 100-300 vuxna och kan hållas inom en-liters glasflaskor (fotavtryck 80 cm 2) fylld tre till fyra centimeter hög (omkring 50 g) med tillväxtmedium som består av full grain vete mjöl kompletterat med inaktiv torrjäst. En vattenförsörjning är inte nödvändigt. Detta gör att även små laboratorier för att hålla dussintals skalbagge kulturer inom små och medelstora kommersiellt tillgängliga insekts inkubatorer. Senare utvecklingsstadier Tribolium (larver efter ungefär den fjärde stadiet, puppor och vuxna) kan lätt separeras från tillväxtmediet genom siktning. Synkroniserade embryon erhålls genom inkubation vuxna för korta perioder på äggläggning medium. För snabb utveckling, är skalbagge kulturer hölls vid 32 ° C (omkring fyra veckor per generation), medan lagerhållning utförs typiskt vid 22-25 ° C (cirka tio veckor per generation).

Inom det senaste decenniet har många standard techniques har successivt anpassas och optimeras för Tribolium, som sammanfattas i Emerging modellorganismer böcker 32. Av stor betydelse är avancerade genetiska metoder såsom embryonal 33, larval 34, 35 eller moder 36, 37 RNA-interferens-baserad gen knockdown, arvslinjetransformation med antingen piggyBac 38, 39 eller Minos 40 transposas systemet och CRISPR / Cas9 baserade genomet engineering 41. Vidare har Tribolium genomet sekvenserats ungefär ett decennium sedan 42, och är nu i den tredje omgången av genomet aggregatet släpp 43, som tillåter effektiv och genomet hela identifiering och systematisk analys av gener 44 </supp> eller andra genetiska element 45, 46. Dessutom, genomen av fyra andra ordningen skalbaggar arter är tillgängliga för jämförande genetiska tillvägagångssätt 47, 48, 49, 50. I association med den sekvense genomet, har två storskaliga genetiska analyser utförts, dvs en infogningsmutagenes skärm 51 och en systematisk RNA-interferens-baserad gen knockdown skärm 52, 53.

Fluorescens levande avbildning med widefield, konfokal eller ljus ark baserad mikroskopi (LSFM) gör det möjligt att observera den embryonala morfologi Tribolium som en funktion av tiden (dvs morfogenes) i en flerdimensionell sammanhang (tabell 1). I Widefield och konfokal fluorescensmikroskopi, den EXCITation och emissionsljuset leds genom samma objektivlins. I bägge metoderna är hela provet belyses för varje inspelad tvådimensionellt plan. Därmed är proverna utsattes för mycket höga energinivåer. I LSFM, endast fluoroforerna i fokalplanet exciteras på grund av en frikoppling av belysning och detektering genom att använda två vinkelrätt anordnade objektivlinser (figur 1). LSFM kommer i två kanonisk implementeringar – den enda plan belysningsmikroskop (SPIM) och den digitala avsökta laserljuset arket baserade fluorescensmikroskop (DSLM, figur 2) – och erbjuder flera avgörande fördelar jämfört med traditionella metoder: (i) inneboende optisk sektione kapacitet, (ii) god axiell upplösning, (iii) kraftigt reducerad nivå av fotoblekning, (iv) mycket låg fototoxicitet, (v) högt signal-till-brusförhållande, (vi) relativt hög uppsamlingshastighet, (vii) imaging längs flera riktningar och (viii) djupare vävnadspenetrering på grund av användningen av låg numerisk apertur belysning objektivlinser 54, 55, 56.

LSFM har redan framgångsrikt tillämpats i Tribolium att dokumentera nästan hela embryonala morfogenes 57 och analysera principerna för extra embryonala membran bristning i början av rygglutning 23. För att höja attraktionskraft LSFM i Tribolium samhället och för insekts vetenskap i allmänhet, är det av stor vikt att etablera standardrutiner och förbättra metoder, protokoll och den pool av resurser till en nivå där mikroskopet blir en enkel att -använda standardverktyg i utvecklingsbiologiska laboratorier och biologiska frågor bo i centrum för uppmärksamheten.

Detta protokoll börjar med grunderna i Tribolium </ em> odling, dvs underhåll, reproduktion och embryosamlings. Nästa, är två experimentella strategier illustreras: (i) levande avbildning av skräddarsydda transgena linjerna och (ii) bildåtergivning av fasta embryon som var färgade med fluorescerande färgämnen (tabell 2). Därefter tre monteringstekniker med något olika ändamål förklaras i detalj (figur 3 och tabell 3): (i) agaroskolonn, (ii) agarosen hemisfären och (iii) den nya spindelvävshållaren. Protokollet förklarar sedan datainsamlings förfarandet med LSFM. Avbildningsmetoder och nyckel överväganden beskrivs. Slutligen embryo hämtning förklaras och förslag på grundläggande databehandling tillhandahålls. I de representativa resultat, aktuella bilddata från två nya skräddarsydda och Glia-blå 58 transgena linjerna visas och de respektive avbildningsdatauppsättningar är anordnade som en nedladdningsbar resurs. Dessutom, avbildadata för fasta embryon som färgades med en mängd olika fluorescensfärgämnen presenteras. Diskussionen fokuserar på kvalitetskontroll, nuvarande begränsningar av levande avbildningsteknik och anpassning av protokollet till andra arter.

Protokollet är skriven för lätta skivbaserade fluorescensmikroskop som är utrustade med en provkammare och en roterbar klämmekanism för standardiserade provhållare 54, 59, 60, vilka typiskt är cylinderformade element tillverkade av metall, plast eller glas med en diameter i millimeterområdet. Protokollet är också lämplig för både kanonisk implementeringar, dvs. SPIM och DSLM, såväl som för uppställningar med två eller flera belysnings- och detekteringsarmarna 61, 62, 63. De representativa resultat visar data i två spektralkanaler, grön (illumination med en 488 nm laser, upptäckt genom ett 525/50 bandpassfilter) och röd (belysning med en 561 nm laser, upptäckt genom ett 607/70 bandpassfilter), men protokollet kan utökas till tre eller fyra spektralkanaler.

Protocol

1. Husbandry av Tribolium kulturer OBS: Standardbetingelser definieras som en inkubationstemperatur av 25 ° C och 70% relativ fuktighet i en 12 h ljus / 12 h mörker-cykel. För mer information om Tribolium djurhållning, respektive riktlinjer finns 64. Detta protokoll kräver två olika mjölbaserade media, som kan framställas i kilogram kvantiteter och lagras under flera månader. Före arbetet med mjöl och inaktiv torrjäst, lagra de…

Representative Results

Detta protokoll beskriver en experimentell ram för fluorescens avbildning av levande eller fixerade och färgade Tribolium embryon med LSFM. På grund av de låga nivåer av fotoblekning och fototoxicitet, en direkt följd av dess optiska sektionering kapacitet, är LSFM särskilt väl lämpad för långsiktig levande avbildning. Den nya AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgen linje uttrycker ett histone2B-mEmerald…

Discussion

Kvalitetskontroll

I levande imaging assays, måste beredningen och inspelningsförfarande vara icke-invasiv, dvs varken den mekaniska och kemiska hantering (insamling, dechorionation, montering på provhållaren) eller den integrerade energibelastningen under observationen bör påverka viabiliteten av provet. För studier som kännetecknar WT utveckling, är det rekommenderat att bara använda data från experiment där embryot överlever inspelningsprocessen, häm…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Sven Plath för teknisk support. Den Glia-blå transgen linje var en vänlig gåva från Gregor Bucher (Göttingen, Tyskland). Forskningen har finansierats av Cluster of Excellence Frankfurt am Main för Makromolekylär (CEF-MC, EXC 115, högtalare Volker Dötsch) beviljades delvis EHKS vid Buchmann Institutet för molekylär Life Sciences (BMLS, regissören Enrico Schleiff) vid Goethe Universität Frankfurt am Main av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 ml B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on “Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on “Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head–a beetle’s view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. 유전학. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap’n’collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity–Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -. M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -. M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. . . Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. 유전학. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, &. #. 2. 7. 2. ;., Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a., Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It’s a bug’s life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).
check_url/kr/55629?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

View Video