ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析
Summary
このプロトコールは、2％エタノールで24時間処理したゼブラフィッシュ幼虫からの肝臓の組織学的分析を記載する。このような急性エタノール処理は、肝臓脂肪症および肝臓血管系の腫脹をもたらす。
Abstract
アルコール性肝疾患（ALD）は、急性または慢性のアルコール乱用による肝臓の損傷を指す。これは、アルコール関連の罹患率および死亡率の主要な原因の1つであり、米国では200万人を超える人々に影響を与える。アルコール誘発肝障害の根底にある細胞および分子メカニズムのより良い理解は、ALDの有効な治療法を開発するために重要である。ゼブラフィッシュの幼虫は、2％エタノールへのわずか24時間の曝露後に肝脂肪症および線維形成を示し、急性アルコール性肝障害の研究に有用である。この研究は、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理の手順を記述し、それが肝臓血管の脂肪症および腫脹を引き起こすことを示している。ゼブラフィッシュの幼虫肝臓の組織学的分析のために最適化されたヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色の詳細なプロトコールも記載されている。 H＆E染色は、免疫蛍光よりもいくつかのユニークな利点があります。細胞外成分を同時に検出することができ、脂肪症および線維症などの肝障害を容易に検出することができる。毒素およびウイルス誘発肝臓損傷ならびに遺伝性肝疾患のモデリングにおけるゼブラフィッシュの使用が増加していることを考えると、このプロトコールは、これらの研究すべてにおいて実施された組織学的分析の参考となる。
Introduction
アルコール過多によって引き起こされるアルコール性肝疾患（Alcoholic Liver Disease：ALD）は、アルコール関連の罹患率および死亡率の主要な原因である。米国では、肝疾患の死亡のほぼ半分がアルコール1を含み、ALDは3回の肝臓移植2のほぼ1つを担っている2 。 ALDには広いスペクトルがあります。肝細胞における過剰脂質蓄積を特徴とする脂肪症は、飲酒の初期段階で起こり、アルコール使用の停止時に可逆的である。遺伝的および環境的要因および継続的アルコール摂取の影響下で、肝臓脂肪症はアルコール性肝炎および結局は肝硬変に進行することがある3 。げっ歯類のALDモデルを用いた研究では、この疾患に対する十分な洞察が得られているが、限界がある（文献3 ）。アルコール飼料の経口給餌は、げっ歯類4 、5 。炎症および線維化の発症には、侵襲的かつ技術的に挑戦的な第2の傷害6,7または慢性胃内注入が必要である8,9 。また、腸骨ジストロフィーは、慢性および急性のアルコール処置10,11,12,13,14,15の両方に応答して肝損傷を発症する。特に、幼虫ゼブラフィッシュは、急性アルコール性肝臓損傷10,11,13,15を研究するための魅力的な補完的モデル生物である。ゼブラフィッシュの肝臓は機能的であり、エタノール代謝の主要な酵素を4日で産生するゼブラフィッシュ幼虫13,15 で肝臓脂肪症および線維形成反応を誘発するには、エタノールを2％エタノールに24時間暴露すれば十分です。
2％エタノールで24時間処理すると、ゼブラフィッシュの幼虫13の組織エタノール濃度が80mMになることが報告されている13 。他の者は、幼虫がこの濃度を許容し、処置動物に見られる肝表現型がエタノール暴露に特異的であることを示した11,13,15,18。しかしながら、ヒトでは80mMがほぼ致命的であるため、エタノール処理されたゼブラフィッシュの肝組織像を評価し、人間との生理学的関連性を明らかにする。
ゼブラフィッシュの幼虫の急速な外部発生および半透明は、肝臓内のアルコールの作用をリアルタイムおよび固定サンプルで特徴付けることを可能にする。細胞型特異的蛍光トランスジェニック系統の利用可能性と共焦点顕微鏡法の最近の進歩により、異なる肝細胞型が急性エタノール処理11,15に応答して形態および挙動をどのように変化させるかの研究が容易になる。しかし、蛍光トランスジェニックゼブラフィッシュの共焦点イメージングは、肝臓組織学を研究する場合、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を完全に代用することはできない。トランスジェニックゼブラフィッシュを用いて全ての肝臓細胞型を同時にマーキングするには、個々のトランスジェニック系統を作製する必要があり、それぞれが固有のフルオロフォアを有する肝臓細胞型を標識する。異なるトランスジェニック背景を同じ魚に導入するには、ブリーディングが必要ですg世代を必要とし、時間とコストがかかる。細胞外マトリックス成分を検出するためには、さらなる免疫蛍光染色が必要である。一方、H＆E染色は、同時に全ての肝臓細胞型および細胞外マトリックス成分を標識し、肝臓の概要を提供する。さらに、肝細胞死、脂肪症および線維症などの肝疾患のいくつかの組織病理学的特徴を容易に明らかにする。 H＆Eは哺乳動物の肝臓組織学におけるルーチンの染色であるが、ゼブラフィッシュの肝臓研究では一般的に使用されておらず、プロトコールはあまり確立されていない。
この研究は、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理およびH＆E染色によるフォローアップ組織学的分析のためのプロトコールを記載する。 H＆E染色プロトコールは、肝臓の発達および機能に関するすべての研究に使用することができる。さらに、パラフィン切片は、免疫組織化学ならびに他の特別なスタチンのために使用することができるTrichrome stain、reticulin stain などの肝臓の病理学的特徴
Protocol
Representative Results
Discussion
現在のプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫における急性エタノール処理およびH＆E染色によるその後の組織病理学的分析の詳細な手順を記載している。急性エタノール処理は、ゼブラフィッシュ肝臓がアルコール代謝酵素を発現し始める段階であるため、受精後96時間以内に行わなければならない。 2％エタノールは、幼虫が13,14を許容できる最大用量である。エタノー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はZebrafish International Resource CenterのKaty Murray博士に感謝したいと思います。 CCHMCのStacey Huppert博士とKari Huppert博士は、プロトコルに関する有益な助言を得た。魚のケアのためのCCHMC獣医サービス。この研究はNIH助成金R00AA020514とCCHMCの小児ゲノミクスセンター（CY）の研究助成金によって支えられました。また、シンシナティの消化器疾患研究コアセンターのNIH助成金P30 DK078392（統合形態学コア）も一部支持した。
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
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