تسخير الحمض النووي صبغ أثار الجانب السكان النمط الظاهري للكشف عن وتنقية الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البيولوجية
Summary
الطرق التي تسمح بتوصيف وعزل السكان الخلايا الجذعية من العينات البيولوجية هي حاسمة لنهوض العلاجات المستهدفة الخلايا الجذعية في السرطان وما بعدها. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الجذعية السرطانية باستخدام النمط الظاهري الجانب الصبغة أثارت الصبغة.
Abstract
السرطان هو مرض يحركها الخلايا الجذعية والقضاء على هذه الخلايا أصبح هدفا علاجيا رئيسيا. فك رموز الضعف في الخلايا الجذعية للسرطان (سسس) وتحديد الأهداف الجزيئية المناسبة تعتمد على الطرق التي تسمح للتمييز محددة في عينات غير متجانسة مثل خطوط الخلايا والأنسجة الورم خارج الجسم الحي . التدفق الخلوي / فاكس هو تقنية قوية ل متعدد بارامتريكالي تشريح العينات البيولوجية على مستوى الخلية واحد، وحتى الآن طريقة الاختيار لاسترداد الخلايا الحية لتحليلات المصب. وكثيرا ما استخدمت علامات السطح مثل CD44 و CD133 وكذلك الكشف عن نشاط الأنزيمية نازعة ألدهيد لتحديد وفرز الخلايا الجذعية السرطانية من عينات الورم من قبل فاكس. نهج تكميلي، هو موضح هنا في التفاصيل المنهجية، يجعل من استخدام قذف الصبغة وظيفية من قبل ناقلات المخدرات أبك، والذي يحدد مجموعة متميزة من الخلايا مضان خافت عادة ما يشار إلى السكان الجانب (سب). SP؛ الخلايا السرطانية تحمل خصائص الخلايا الجذعية الكنسي ويمكن إلغاؤها وأكد وظيفيا باستخدام العوامل التي تمنع نقل المخدرات صبغة البثق (في كثير من الأحيان ABCB1 / P- سكري بروتين / MDR1 / CD243 و ABCG2 / Bcrp1 / CD338). وعلاوة على ذلك، فإن فحص سب متوافق مع غيرها من التقييمات سايتوميتريك تدفق مثل تلطيخ المستضدات السطحية، كشف ألدهيد نازعة والتمييز الخلايا الميتة (على سبيل المثال ، مع 7-آد أو يوديد بروبيديوم (بي)). وهكذا، فإننا تصف طريقة قيمة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحديد كسك والعزلة وتوصيف الفرعي ميكانيكيا على أساس وظيفية، بدلا من المعلمة المظهرية. على الرغم من أن يؤدي أصلا مع هويشت 33342 كما اثار الصبغة، ونحن هنا التركيز على أحدث النمط الظاهري صبغة البنفسجي سب التي يمكن حلها على أي تدفق مقياس التدفق الخلوي مجهزة مصدر الليزر البنفسجي.
Introduction
وقد تحسنت فعالية العلاجات السرطانية الأولية بشكل كبير على مدى العقد الماضي بسبب التقدم الجذري في الفهم الجيني والجزيئي للمرض وظهور الأدوية المستهدفة مثل الأجسام المضادة العلاجية ومثبطات جزيء صغير. وعلى النقيض من ذلك، لا يزال المرض المنتشر والمتكرر غير قابل للشفاء عادة، ولا تزال معدلات الاعتلال والوفيات مرتفعة في هذه الأوضاع السريرية. الخلايا الجذعية السرطانية تمثل شريحة فرعية متميزة داخل الأورام، وهبت مع خصائص الخلايا الجذعية الأساسية مثل كلونوجينيسيتي / توموريجنيسيتي، ومقاومة متعددة المخدرات وتقسيم الخلايا غير المتماثلة 1 ، 2 . وبالتالي، الخلايا الجذعية السرطانية ليس فقط دفع تطور النقيلي وتغير الورم، ولكن أيضا تستمر خلال فترة العلاج لتهدئة المريض إلى الانتكاس. ولذلك فإن التخلص من كسك العلاجي هو حاجة طبية هامة لمنع تكرار المرض والسماح للعلاج على المدى الطويل من السرطان 3 </suص>.
ويتوقف تحديد مواطن الضعف وتوضيح الاستراتيجيات الرامية إلى القضاء على الخلايا الجذعية السرطانية بشكل كبير على الطرق التي تسمح بتنقيتها من العينات البيولوجية لتصنيف التعبير اللاحق و / أو التحقيق الوظيفي. في المقابل، تعتمد هذه الأساليب على علامات سطحية أو داخل الخلايا أو وظيفية محددة لهذه الخلايا. وتشمل علامات سطح كسك الخاصة، على سبيل المثال لا الحصر، CD44، CD133، CD24 و CD90، وقد استخدمت لتحديد سكان الخلايا الجذعية السرطانية في مجموعة متنوعة من كيانات الورم بما في ذلك سرطان الثدي وسرطان القولون 4 . علامة أخرى، ألدهيد نازعة (ألد)، ويظهر توطين الخلايا ويمكن الكشف وظيفيا توفير الركيزة منها التي تنتج التحويل الأنزيمي الضوء. باستخدام هذا الاختبار، تم تحديد السكان كسك في كيانات الورم متنوعة وكذلك 5 . طريقة تكميلية، ويشار إليها عادة باسم تحليل سب وتصوير هنا في م تفاصيل إيثودولوجيكال، تسخير إفلوكس صبغ نشط من قبل ناقلات المخدرات أبك لتحديد مجموعات صغيرة من الخلايا مضان خافت الجذعية مثل 6 ، 7 ، 8 . لتحقيق ذلك، يتم حضانة عينة معينة في وجود فلوراوفور ملزم للدهون الحمض النووي الذي يدخل جميع الخلايا من خلال نشر السلبي ويستهدف الحمض النووي النووي والميتوكوندريا لالتزام. غير الخلايا الجذعية السرطانية خالي من التعبير أبك نقل المخدرات تتراكم الصبغة مما أدى إلى مضان مضيئة، في حين أن الخلايا الجذعية السرطانية قذف بنشاط الصبغة التي تقلل مضان. تثبيط الدوائية من نشاط نقل المخدرات يلغي ويؤكد وظيفيا النمط الظاهري سب ويجب أن تستخدم لأغراض التحكم. وقد تم الكشف عن السكان كسك المعرضة خصائص سب، من بين أمور أخرى، في سرطان المبيض 9 ، 10 ، سرطان البروستاتا 11 ،> 12، سرطان الثدي 13 ، سرطان الرئة 14 ، سرطان بطانة الرحم 15 ، الورم 16 و 17 والساركوما العظام 18 . الأهم من ذلك، فحص سب متوافق مع كل من خطوط الخلايا السرطانية والأنسجة الورم الأولية، على الرغم من أن المواد الأولية يطرح تحديات إضافية مثل شرط لاستراتيجية محددة لتمييز الخلايا السرطانية (بعض السكان خلية المضيف يمكن أن يحمل خصائص سب كذلك) 19 ، 20 .
إن اثنين من أكثر ناقلات المخدرات المخدرة من نوع سب هي: ABCB1 / P-غليكوبروتين / MDR1 / CD243 و ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 ، 9 ، 21 ؛ ومع ذلك، يمكن أن ناقلات المخدرات الأخرى يكون محدد الجزيئي للنمط الظاهري سب أيضا (على سبيل المثال ، ABCB5) 22 . ABCB1يمكن أن تكون معزولة بكفاءة مع فيراباميل في حين أن نشاط ABCG2 يمكن إلغاؤها على وجه التحديد مع فومترمورجين C (فتس) 6 ، 19 . قوة معينة من تحليل سب هو أنه يمكن دمجها مع تلطيخ أخرى (على سبيل المثال ، علامات السطح و ألد) وأنه يسمح استعادة الخلية الحية وبالتالي تتوافق مع التحقيقات الوظيفية المصب. وعلاوة على ذلك، كشف سب ينطبق على نطاق واسع بسبب ارتفاع حفظ ناقلات المخدرات أبك بين السكان لجنة كسك 9 ، 23 .
في الأصل، تم إجراء الكشف سب باستخدام هويشت 33342 باعتباره صباغة اثار 24 . هذا الصبغة يحقق قرار ممتاز ولكنه يتطلب الإثارة الليزر فوق البنفسجية. وبالتالي تطبيقه يقتصر بطبيعة الحال إلى الصكوك تدفق سايتوميتريك الراقية. وقد افتتح ظهور دييكل البنفسجي (دكف) 25 أفينو جديدةإس لتحليل سب وتوسيع نطاق تطبيق هذه الطريقة إلى الصكوك تدفق سايتوميتريك القياسية تفتقر إلى مصدر ليزر الأشعة فوق البنفسجية (مصدر الليزر البنفسجي يكفي لحل الخلايا دكف-سب). الأهم من ذلك، هويشست 33342 و دكف حصة الخصائص مضخة مشتركة، مشيرا إلى أن إما صبغ يجب تحديد نفس السكان الخلية.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول تجريبي مفصل من تحليل سب القائم على دكف لسرعة وسهولة الاستنساخ في مختبرات مستقلة. وبالتالي فإننا نرى مقالنا كمورد للباحثين كسك التي ينبغي أن تسهم في تحسين وتوحيد هذه الطريقة البيولوجية البيولوجية مفيدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما يعتمد التقدم في الإدارة السريرية للسرطان على تطوير طرائق العلاج التي تستهدف الخلايا الجذعية السرطانية. وستسرع طرق السماح لعزل الخلايا الجذعية السرطانية الموثوق بها من العينات البيولوجية بتحديد الأهداف المناسبة، ولذلك فهي ذات أهمية حاسمة في هذا المسعى. تحليل س?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم ماكسيميليان بوتش من قبل زمالة إروين شرودنجر من صندوق العلوم النمساوية فوف (رقم المنحة J-3807).
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose?. Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
