Aprovação do DNA Dye-desencadeada fenótipo de população lateral para detectar e purificar células-tronco de câncer de amostras biológicas
Summary
Métodos que permitem a caracterização e isolamento de populações de células estaminais a partir de amostras biológicas são fundamentais para o avanço de células-tronco-alvo tratamentos em câncer e além. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de células estaminais do câncer usando o fenótipo de população lateral desencadeada por corante.
Abstract
O câncer é uma doença causada por células-tronco e a erradicação dessas células tornou-se um importante objetivo terapêutico. A decifração de vulnerabilidades de Células-Tronco de Câncer (CSCs) e a identificação de alvos moleculares adequados baseiam-se em métodos que permitem a sua discriminação específica em amostras heterogéneas, tais como linhas celulares e tecido tumoral ex vivo . Citometria de fluxo / FACS é uma tecnologia poderosa para multi-parametricamente dissecar amostras biológicas no nível de célula única e é até à data o método de escolha para recuperar células vivas para análises a jusante. Os marcadores de superfície tais como CD44 e CD133, bem como a detecção de actividade enzimática de aldeído desidrogenase, têm sido frequentemente utilizados para definir e separar CSCs de amostras de tumor por FACS. Uma abordagem complementar, aqui descrita em detalhe metodológico, utiliza a extrusão de corante funcional por transportadores de fármacos ABC, que identifica uma população distinta de células fluorescentes-dim vulgarmente designadas por população lateral (SP). SP, As células de cancro exibem características de células estaminais canónicas e podem ser anuladas e confirmadas funcionalmente utilizando agentes que inibem o transportador de fármaco de extrusão de corantes (mais frequentemente ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Além disso, o ensaio SP é compatível com outras avaliações de citometria de fluxo, tais como coloração de antigénios de superfície, detecção de aldeído desidrogenase e discriminação de células mortas ( por exemplo , com 7-AAD ou iodeto de propídio (PI)). Assim, descrevemos um método valioso e amplamente aplicável para identificação, isolamento e sub-caracterização de CSC mecanisticamente baseado em um parâmetro funcional, e não fenotípico. Embora inicialmente realizado com Hoechst 33342 como corante desencadeante, aqui focalizamos o mais recente Violeta corante baseada em fenótipo SP que é resolvível em qualquer citómetro de fluxo equipado com uma fonte de laser violeta.
Introduction
A eficácia das terapias primárias contra o cancro melhorou substancialmente durante a última década devido aos avanços convincentes na compreensão genética e molecular da doença e ao advento de fármacos direccionados tais como anticorpos terapêuticos e inibidores de moléculas pequenas. Em contraste, a doença metastática e recorrente ainda é tipicamente incurável, ea morbidade e mortalidade permanecem altas nestes cenários clínicos. As CSCs representam uma subpopulação distinta dentro dos tumores e são dotadas de propriedades de células estaminais canónicas tais como clonogenicidade / tumorigenicidade, resistência a múltiplos fármacos e divisão celular assimétrica 1 , 2 . Assim, as CSCs não apenas conduzem à progressão metastática e à heterogeneidade tumoral, mas também persistem durante o tratamento para predispor o paciente a recaída. Terapêutica CSC eliminação é, portanto, uma importante necessidade médica para prevenir a recorrência da doença e permitir a longo prazo cura do câncer 3 </suP>.
A identificação de vulnerabilidades e elucidação de estratégias para erradicar CSC depende fortemente de métodos que permitam a sua purificação a partir de amostras biológicas para posterior perfil de expressão e / ou investigação funcional. Por sua vez, tais métodos dependem de marcadores de superfície, intracelulares ou funcionais que são específicos para estas células. Os marcadores de superfície específicos para CSC incluem, mas não estão limitados a, CD44, CD133, CD24 e CD90 e foram utilizados para identificar populações de CSC numa variedade de entidades tumorais incluindo cancro da mama e cancro do cólon 4 . Outro marcador, a aldeído desidrogenase (ALDH), apresenta localização intracelular e pode ser detectado funcionalmente proporcionando um substrato respectivo cuja conversão enzimática produz luz. Utilizando este teste, as populações CSC foram também identificadas em diversas entidades tumorais 5 . Um método complementar, comumente referido como análise SP e retratado aqui em m Detalhe etodológico, aproveita o efluxo de corante ativo por transportadores de droga ABC para identificar pequenas populações de células fluorescentes dim-stem-like 6 , 7 , 8 . Para conseguir isto, uma determinada amostra é incubada na presença de um fluoróforo de ligação ao ADN lipófilo que penetra em todas as células através de difusão passiva e alveja ADN nuclear e mitocondrial para ligação. Os não-CSCs desprovidos de expressão de transportador de droga ABC acumulam o corante resultando em fluorescência brilhante, ao passo que os CSCs extrudem activamente o corante que reduz a fluorescência. A inibi�o farmacol�ica da actividade do transportador de f�maco anula e confirma funcionalmente o fen�ipo de SP e deve ser utilizada para fins de controlo. As populações de CSC que exibem características de SP foram reveladas, entre outras, no cancro do ovário 9 , 10 , cancro da próstata 11 ,> 12, cancro da mama 13 , cancro do pulmão 14 , cancro endometrial 15 , glioma 16 , 17 e sarcoma ósseo 18 . Importante, o ensaio de SP é compatível com ambas as linhas celulares de cancro e tecido de tumor primário, embora o material primário apresente desafios adicionais tais como a exigência de uma estratégia de discriminação de células tumorais específicas (certas populações de células hospedeiras também podem exibir características de SP) 19 , 20 .
Os dois transportadores de fármaco que conferem SP mais estabelecidos são ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; No entanto, outros transportadores de droga podem ser um determinante molecular do fenótipo SP também ( por exemplo , ABCB5) 22 . ABCB1Pode ser eficazmente bloqueada com verapamil enquanto que a actividade de ABCG2 pode ser especificamente revogada com fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . Uma força particular da análise de SP é que ela pode ser combinada com outras colorações ( por exemplo , marcadores de superfície e ALDH) e que permite a recuperação de células vivas sendo assim compatível com investigações funcionais a jusante. Além disso, a detecção de SP é amplamente aplicável devido à alta conservação de transportadores de droga ABC entre as populações CSC 9 , 23 .
Originalmente, a detec�o SP foi realizada utilizando Hoechst 33342 como um corante desencadeante 24 . Este corante atinge uma resolução excelente, mas requer a excitação do laser ultravioleta; Daí a sua aplicabilidade é naturalmente limitada a instrumentos de citometria de fluxo high-end. O advento do DyeCycle Violet (DCV) 25 abriu nova avenidaEs para análise de SP e estendeu a aplicabilidade deste método aos instrumentos de citometria de fluxo padrão sem fonte de laser ultravioleta (uma fonte de laser violeta é suficiente para resolver as células DCV-SP). Importante, Hoechst 33342 e DCV compartilham especificidades de bomba comuns, indicando que qualquer corante deve identificar as mesmas populações de células.
Aqui, fornecemos um protocolo experimental detalhado de análise de SP baseada em DCV para reprodução rápida e fácil em laboratórios independentes. Assim, percebemos nosso artigo como um recurso para os pesquisadores da CSC que deve contribuir para a otimização e padronização deste útil método biológico-celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
O progresso no manejo clínico do câncer também depende do desenvolvimento de modalidades de tratamento que visam as CSCs. Métodos que permitem o isolamento fiável de CSCs a partir de amostras biológicas irão acelerar a identificação de alvos adequados e são, portanto, de importância crítica neste esforço. SP é uma técnica estabelecida e valiosa para identificar populações de CSC que expressam transportadores de droga ABC e a implementação de DCV ampliou sua aplicabilidade a instrumentos de citometria …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maximilian Boesch é apoiado por uma Erwin Schrödinger Fellowship do Austrian Science Fund FWF (concessão número J-3807).
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
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