Sfruttamento del fenotipo della popolazione laterale innescato dal DNA per rilevare e purificare le cellule staminali del cancro da campioni biologici
Summary
I metodi che consentono la caratterizzazione e l'isolamento delle popolazioni di cellule staminali da campioni biologici sono critici per l'avanzamento dei trattamenti mirati alle cellule staminali nei cancri e oltre. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule staminali del cancro usando il fenotipo della popolazione laterale innescato dal colorante.
Abstract
Il cancro è una malattia a base di cellule staminali e l'eradicazione di queste cellule è diventata un importante obiettivo terapeutico. Decifrare le vulnerabilità delle cellule staminali del cancro (CSC) e identificare opportuni obiettivi molecolari si basa su metodi che permettono la loro discriminazione specifica in campioni eterogenei come linee cellulari e tessuti tumorali ex vivo . La citometria di flusso / FACS è una tecnologia potente per analizzare in maniera multiparametrica campioni biologici a livello di singola cellula e finora è il metodo di scelta per recuperare le cellule vive per analisi a valle. I marcatori di superficie come CD44 e CD133 e la rilevazione di attività enzimatica di aldeideideideide sono state spesso utilizzate per definire e risolvere CSC da campioni tumorali da parte di FACS. Un approccio complementare, descritto qui in dettaglio metodologico, utilizza l'estrusione funzionale di coloranti da parte dei trasportatori di farmaci ABC, che identifica una popolazione distinta di cellule di fluorescenza dimamente comunemente definite come popolazione laterale (SP). SP, Le cellule tumorali presentano caratteristiche delle cellule staminali canoniche e possono essere abrogate e confermate funzionalmente utilizzando agenti che inibiscono il trasportatore di droga estrudente (più spesso ABCB1 / P-glicoproteina / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Inoltre, il saggio SP è compatibile con altre valutazioni citometriche di flusso, quali la colorazione di antigeni superficiali, la rilevazione di deidrogenasi di aldeide e la discriminazione delle cellule morte ( ad es . Con 7-AAD o ioduro di propidium (PI)). Quindi descriviamo un metodo prezioso e ampiamente applicabile per l'identificazione, l'isolamento e la sub-caratterizzazione CSC meccanicamente basata su un parametro funzionale, piuttosto che fenotipico. Anche se in origine viene eseguito con Hoechst 33342 come tintura di innesco, qui ci concentriamo sul più recente fenotipo SP a base di coloranti Violet che è risolvibile su qualsiasi cytometro di flusso dotato di una sorgente laser viola.
Introduction
L'efficacia delle terapie tumorali primarie è migliorata sostanzialmente nell'ultimo decennio a causa di progressi impellenti nella comprensione genetica e molecolare della malattia e l'avvento di farmaci mirati come anticorpi terapeutici e inibitori di piccole molecole. Al contrario, la malattia metastatica e recidiva è ancora tipicamente incurabile e la morbilità e la mortalità rimangono elevate in questi ambiti clinici. I CSC rappresentano una sottopopolazione distinta all'interno dei tumori e sono dotate di proprietà canoniche delle cellule staminali come la clonogenicità / tumorigenicità, la resistenza multi-farmaco e la divisione asimmetrica delle cellule 1 , 2 . Così, i CSC non solo guidano la progressione metastatica e l'eterogeneità dei tumori, ma persistono anche durante il trattamento per predisporre il paziente alla ricaduta. L'eliminazione terapeutica del CSC è quindi un importante bisogno medico per prevenire la ricorrenza delle malattie e consentire la cura a lungo termine del cancro 3 </sup>.
L'identificazione delle vulnerabilità e la spiegazione delle strategie di eradicazione dei CSC dipendono fortemente da metodi che permettono la loro depurazione da campioni biologici per la successiva profilazione dell'espressione e / o l'analisi funzionale. A loro volta, tali metodi si basano su marcatori superficiali, intracellulari o funzionali che sono specifici per queste cellule. I marcatori di superficie specifici del CSC includono, ma non sono limitati a, CD44, CD133, CD24 e CD90 e sono stati utilizzati per identificare le popolazioni CSC in una varietà di entità tumorali tra cui il cancro al seno e il cancro del colon 4 . Un altro marcatore, l'aldehyde dehydrogenase (ALDH), mostra localizzazione intracellulare e può essere rilevato funzionalmente fornendo un rispettivo substrato la cui conversione enzimatica produce luce. Utilizzando questo test, le popolazioni CSC sono state identificate anche in diverse entità tumorali 5 . Un metodo complementare, comunemente indicato come analisi SP e rappresentato qui in m Dettaglio etodologico, utilizza efflux attivo di coloranti da parte dei trasportatori di droga ABC per identificare piccole popolazioni di cellule simili allo stelo-like fluorescenza 6 , 7 , 8 . A tal fine, un determinato campione viene incubato in presenza di un fluoroforo lipofilico legato al DNA che entra in tutte le cellule attraverso la diffusione passiva e colpisce DNA nucleare e mitocondriale per il legame. Non-CSC privi di espressione di trasportatore di droga ABC accumulano il colorante con conseguente fluorescenza luminosa, mentre CSC estrudono attivamente il colorante che riduce la fluorescenza. L'inibizione farmacologica dell'attività del trasportatore di farmaci abroga e conferma funzionalmente il fenotipo della SP e deve essere utilizzato per scopi di controllo. Le popolazioni CSC che presentano caratteristiche SP sono state divulgate, tra l'altro, nei tumori ovarici 9 , 10 , cancro alla prostata 11 ,> 12, cancro mammario 13 , cancro polmonare 14 , cancro endometriale 15 , glioma 16 , 17 e sarcoma osseo 18 . Importante, il saggio SP è compatibile sia con le linee cellulari sia con i tessuti tumorali primari, anche se il materiale primario presenta ulteriori sfide, come il requisito di una specifica strategia di discriminazione delle cellule tumorali (alcune popolazioni delle cellule ospitanti possono anche esibire le caratteristiche della SP) 19 , 20 .
I due più tradizionali trasportatori di farmaci che forniscono SP sono ABCB1 / P-glicoproteina / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Tuttavia, altri trasportatori di farmaci possono essere un determinante molecolare del fenotipo SP ( ad es. , ABCB5) 22 . ABCB1Possono essere bloccati in modo efficace con verapamil mentre l'attività di ABCG2 può essere specificamente abrogata con fumitremorgina C (FTC) 6,19. Una particolare forza di analisi SP è che può essere combinata con altri colorazioni ( ad esempio , marcatori superficiali e ALDH) e che consente il recupero delle cellule vive in modo compatibile con le indagini funzionali a valle. Inoltre, la rilevazione di SP è ampiamente applicabile a causa dell'alta conservazione dei trasportatori di farmaci ABC tra le popolazioni CSC 9 , 23 .
In origine, il rilevamento della SP è stato eseguito usando Hoechst 33342 come un colorante di innesco 24 . Questo colorante raggiunge un'ottima risoluzione ma richiede l'eccitazione laser ultravioletta; Pertanto la sua applicabilità è naturalmente limitata agli strumenti citometrici a flusso di alta gamma. L'avvento di DyeCycle Violet (DCV) 25 ha aperto un nuovo avenuEs per l'analisi SP e ha esteso l'applicabilità di questo metodo a standard strumenti citometrici a flusso senza una sorgente laser ultravioletta (una sorgente laser viola è sufficiente a risolvere le cellule DCV-SP). Importante, Hoechst 33342 e DCV condividono le specifiche specifiche della pompa, indicando che entrambi i coloranti dovrebbero identificare le stesse popolazioni cellulari.
Qui forniamo un protocollo sperimentale dettagliato di analisi SP basata su DCV per una riproduzione rapida e facile in laboratori indipendenti. Riconosciamo pertanto il nostro articolo come risorsa per i ricercatori CSC che dovrebbero contribuire all'ottimizzazione e alla standardizzazione di questo metodo cellulare-biologico utile.
Protocol
Representative Results
Discussion
I progressi nella gestione clinica del cancro dipendono anche dallo sviluppo delle modalità di trattamento che mirano ai CSC. I metodi che consentono l'isolamento affidabile dei CSC da campioni biologici accelerano l'individuazione di obiettivi idonei e sono quindi di fondamentale importanza in questo sforzo. L'analisi SP è una tecnica consolidata e preziosa per identificare le popolazioni CSC che esprimono i trasportatori di farmaci ABC e l'implementazione di DCV ha esteso la sua applicabilità agli s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maximilian Boesch è sostenuto da una borsa Erwin Schrödinger del Fondo australiano di scienze FWF (numero di sovvenzione J-3807).
Materials
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
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