Qui, la citometria a flusso di imaging multispectrale con una caratteristica analitica che confronta immagini luminose di dettagli di 3 marcatori autofag e quantifica la loro co-localizzazione, insieme al conteggio spot LC3, è stata utilizzata per misurare l'autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.
L'autofagia è un percorso catabolico in cui i componenti cellulari normali o disfunzionali che si accumulano durante la crescita e la differenziazione sono degradati attraverso il lisosoma e vengono riciclati. Durante l'autofagia, la proteina LC3 citoplasmatica viene lipidizzata e reclutata alle membrane autofagosomali. L'autofaggo quindi si fonde con il lisosoma per formare l'autolysosoma, dove si verifica la rottura della vescicola di autofagosoma e il suo contenuto. La proteina associata con ubiquitina p62, che si lega a LC3, è anche usata per monitorare il flusso autofagico. Le cellule sottoposte a autofagia dovrebbero dimostrare la co-localizzazione di marcatori p62, LC3 e lisosomiali. La microscopia immunofluorescenza è stata usata per identificare visivamente LC3 puncta, p62 e / o lysosomi su base per cellula. Tuttavia, può essere difficile ottenere una valutazione oggettiva e statisticamente rigorosa. Per ovviare a questi problemi, è stata utilizzata citometria di flusso multispectrale di imaging e una caratteristica analitica che confronta la luminosità(LC3, p62 e lysosomal LAMP1) e quantifica la loro co-localizzazione in combinazione con il conteggio dei punti LC3 per misurare l'autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.
Macroautophagy, qui di seguito denominato autophagy, è un percorso catabolico in cui i componenti danneggiati o disfunzionali, le proteine a lungo termine e gli organelli sono degradati attraverso il lisosoma e vengono riciclati 1 . L'autofagia è un processo dinamico e multistep che coinvolge la formazione di un autofago; La fusione dell'autofaggo con il lisosoma, formando l'autolysosoma; E il degrado del contenuto dell'autolysosoma 2 . Il marcatore biologico cruciale utilizzato per identificare l'autofagia nei sistemi di mammiferi è la catena leggera 1A / 1B-light 3 (LC3) legata alla microtubula, che costituisce la membrana autofagosomica. Durante l'autofagia, LC3-1 citosolico è coniugato alla fosfatidiletiletanolo per formare LC3-II; LC3-II è quindi incorporato nella membrana autofosfoma 3 . Un altro marcatore ampiamente utilizzato per il flusso autofagico è il sequestosoma 1 del recettore autofagico (SQSTM1, p62) che fisicamente liNks cargo autofagico alla membrana autofagica 4 , 5 .
I metodi tradizionalmente utilizzati per misurare l'autofagia sono blots occidentali e microscopia a fluorescenza 7 . Tuttavia, nessuno di questi metodi è considerato come "standard d'oro" , 2 , 6 poiché ci sono sfide associate a entrambe queste tecniche. Le macchie occidentali danno solo una media perché usano un campione omogeneo, in modo che gli osservatori non riescano a vedere cosa succede nelle singole cellule. D'altra parte, la microscopia a fluorescenza dà informazioni a livello di singola cellula, ma manca di capacità di trasmissione, rendendo difficile ottenere valutazioni oggettive e statisticamente rigorose. Negli ultimi anni la misurazione di LC3 e p62 mediante citometria a flusso di imaging multispectrale (MIFC, vedi tabella dei materiali ) sta guadagnando popuLeggerezza dovuta al suo potere quantitativo, alle capacità di trasmissione elevata, al potenziale di multiplexing e alla capacità di immagine di ogni cella. Uno dei metodi più utilizzati per misurare l'autofagia utilizzando il MIFC, insieme al software di analisi companion (vedi tabella dei materiali ), è attraverso il conteggio a spot di LC3 puncta o autofagosomi 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Tuttavia, un aumento degli autofosomi non implica necessariamente un aumento dell'autofagia, in quanto potrebbe anche rappresentare un blocco nel processo 2 . Il fatturato LC3-II è un parametro utile per misurare il flusso autofagico analizzando le cellule in presenza eAssenza di un inibitore della degradazione lisosomiale, come la clorochina. Il clorochina inibisce la fusione dell'autofaggoma al lisosoma, consentendo così la quantitazione della formazione di autofaggo come misura del grado di autofagia arrestando il flusso autofagico prima che possa verificarsi il degrado lisosomico 18 . Inoltre, p62 è degradato principalmente da autofagia, e se la degradazione lisosomiale della autofagosoma e il suo contenuto è bloccato, un accumulo di p62 è previsto 17, 19.
L'autofagia è un processo multistep e la misurazione di LC3 o p62 da solo non fornisce un quadro completo di ciò che sta accadendo nelle cellule. Le pubblicazioni recenti hanno sottolineato la necessità di esaminare la formazione concorrente dell'autolysosoma 2 , 17 , 20 , 21 . Il MIFC èunica in grado di misurare la formazione della autolysosome dal imaging del co-localizzazione del autofagosoma al lisosoma 15 – 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Inoltre, è stata esplorata la co-localizzazione di p62 e LC3 utilizzando MIFC per misurare il flusso autofagico 5 . Nel software di analisi di riferimento, la "funzionalità" che misura la co-localizzazione è chiamata "Bright Detail Similarity R3" (BDS) ed è stata specificamente progettata per confrontare i piccoli dettagli luminosi di due immagini. BDS è il coefficiente di correlazione Pearson trasformato dal log con i punti luminosi localizzati con un raggio di 3 pixel o meno; In altre parole, il BDS calcola il grado di oConfronta pixel da due diversi canali fluorescenti. I punti luminosi sono correlati ( cioè, la stessa posizione spaziale) o non correlati ( vale a dire differenti posizioni spaziali). Pertanto, il coefficiente di correlazione varia tra 0 (non correlato) e 1 (perfetta correlazione). Il coefficiente è log-trasformato per aumentare l'intervallo tra zero e infinito 26 , 27 . BDS da solo potrebbe non essere sufficiente; Rajan et al. Ha scoperto che l'utilizzo di solo BDS potrebbe portare a risultati falsi positivi o falsi negativi 21 . BDS valuta la co-localizzazione di due marcatori di autofagia, ma non prende in considerazione il numero di autofosomi. Per tenere conto del numero di autofosomi, Rajan et al. Incluso il punteggio a punti della LC3 puncta 21 . Rajan et al. Ha proposto di utilizzare un diagramma di dispersione bivariato di punti spot LC3 contro BDS. Utilizzando questa trama bivariata, due popolazioni sono andateE in primo luogo identificato: uno con le cellule che hanno un alto livello di LC3 e uno con le cellule che hanno un basso livello di LC3 macchie. La popolazione a punti LC3 è stata ulteriormente classificata in due popolazioni: le cellule con bassa co-localizzazione ( ossia l' accumulo di autofosomi) e le cellule con elevata co-localizzazione ( ossia l' accumulo di autolysosomi). Questa trama bivariata permette di distinguere tra cellule con pochi autofosomi e cellule con un accumulo di autofosomi e / o autolysosomi 21 .
Fino ad ora la co-localizzazione simultanea di LC3, p62 e LAMP1 (marker lizosomico) non era possibile utilizzando un singolo "tipo di funzionalità" nel software di analisi del companion MIFC (vedi tabella dei materiali ). Tuttavia, una nuova funzionalità, recentemente introdotta nella versione 6.1, si chiama Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 confronta le immagini del dettaglio luminoso da ciascuna delle tre immagini (in questo caso, LC3, p62 e LAMP1) e quantifica la co-localizzazione delle tre sonde ( es. LC3, p62 e LAMP1). La funzione BDC3 calcola il coefficiente di correlazione di Pearson modificato per estendersi a tre immagini. Poiché le macchie luminose nelle tre immagini sono correlate o non correlate, il coefficiente di correlazione varia tra 0 (non correlato) e 1 (perfetta correlazione). Il coefficiente è log-trasformato per aumentare l'intervallo dinamico tra 0 e infinito. Attivando la funzione BDS con la funzione BDC3, il metodo di analisi presentato da Rajan et al. Ora possono incorporare i tre indicatori più utilizzati per misurare l'autofagia in un unico sistema contemporaneamente. La capacità di co-localizzare questi tre marcatori di autofagia in un singolo dosaggio potrebbe portare a nuovi approfondimenti sull'induzione e la regolazione dell'autofagia. Il seguente protocollo descrive i passi per indurre l'autofagia nelle cellule Jurkat; Etichettare le cellule con gli anticorpi LC3, p62 e LAMP1; Acquisire dati su un multispCitometro di flusso ectrale di imaging; E analizzare i dati per valutare il flusso autofagico.
Quando si esegue questa analisi, ci sono alcune cose da considerare. È importante avere campioni di controllo appropriati. Per questo esperimento sono stati utilizzati due diversi controlli: Controllo e Controllo + Chloroquine. Il campione di controllo è stato utilizzato per impostare la soglia per le regioni. Rappresenta il livello basale dell'autofagia senza interrompere il degrado lisosomico ed è il controllo del campione di Starved. Tuttavia, il campione di controllo non è un controllo appropriato da confrontare con i risultati del campione di Starved + Chloroquine, in quanto il clorochina influisce sul campione di controllo. Pertanto, è stato necessario avere un campione Control + Chloroquine.
Prima di effettuare qualsiasi analisi per l'autofag, è importante analizzare / portare solo su singole celle che sono in messa a fuoco (ad esempio, gradiente RMS maggiore di 60), in quanto i risultati potrebbero essere influenzati se c'è più di una cella o le immagini sono sfocato. È fondamentale che l'autofagoEs e lisosomi sono al centro per il rilevamento corretto dei punti e l'analisi BDC3. Le cellule apoptotiche devono essere rimosse prima dell'analisi dell'autofagia, in quanto possono risultare incline e non devono essere incluse. Ci dovrebbe essere una colorazione appropriata per tutti e tre i marcatori (ad es. LC3, p62 e LAMP1). Ad esempio, tutti e tre i marcatori sono intracellulari e devono avere un segnale punctato; Se il segnale non è punctato, o se è sulla superficie della cella, la colorazione non sarebbe appropriata e l'esperimento / colorazione dovrebbe essere rifatta. Inoltre, affinché la BDC3 sia accurata, è fondamentale portare le celle che sono luminose per tutti e tre i marcatori fluorescenti di interesse. È necessario disporre di eventi positivi per impedire la misura di BDC3 su manufatti non specifici, artefatti di imaging e / o rumore. Ciò è cruciale, poiché BDC3 può potenzialmente amplificare gli artefatti che non sono veri segnali. Poiché BDC3 può essere eseguito solo su eventi luminosi positivi, molte celle potrebbero non essere incluse nell'analisi finale; Questo è especVale per le celle di controllo che non hanno alcuna accumulazione di LC3, p62 e / o LAMP1. Pertanto, una limitazione di questo test è che BDC3 esamina solo le cellule positive per tutti e tre i marker, che potrebbero non essere appropriati per tutti gli esperimenti di autofagia.
Come il BDS, che è stato precedentemente riportato 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 da solo non tiene conto del numero di organismi di autofagia che co-localizzano, risultando in larga misura Di variabilità nel numero di autofosomi. Pertanto, l'approccio bivariato presentato da Rajan et al. era impiegato. Guardando le trame bivariate, si potrebbe chiedere seLe cellule devono essere positive per LC3, p62 e LAMP1; Perché ci sono tante cellule che hanno 0 punti? Questo perché il segnale LC3 potrebbe essere abbastanza luminoso per la co-localizzazione, ma potrebbe non soddisfare la soglia impostata dalla maschera di picco (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) necessaria per essere considerata una individuare.
Il protocollo qui presentato ha usato il MIFC per contare puncta LC3 e la co-localizzazione di tre marcatori autofagia per misurare il flusso autofagico. In condizioni basali (campione di controllo), il numero di autofagosomi era basso e alcune cellule sono state trovate con "High Spots". Con l'aggiunta di clorochina, che inibisce la fusione di autosfosi / lisosomi, si è verificato un aumento del numero di macchie LC3. Dal momento che il lisosoma non è in grado di abbattere l'autofagogo e il p62, che risiede nell'autofago, ciò porta ad un aumento della co-localizzazione dell'accumulo di autolysosomi LC3, p62 e LAMP1. Questo effetto è stato amplificato sotto lo starvat nutrienteIone, che induce autofagia. Tuttavia, senza l'aggiunta di clorochina, non vi è stato un aumento significativo del numero di autofosomi, probabilmente a causa di un aumento del tasso di turnover autofagico. Quando le cellule sono state affamate in presenza di clorochina, vi è stato un aumento della co-localizzazione e il numero di autofosomi, che supporta la conclusione che la fame aumenta il flusso autofagico. EBSS è noto per essere un potente induttore di autofagia. Pertanto, si prevede che l'aumento sia grande. Se si utilizza un altro metodo, ad esempio l'induzione di farmaci, per indurre l'autofagia, la differenza tra i controlli e quelli trattati può essere più sottile.
Questo particolare protocollo è stato progettato per misurare l'autofagia nelle linee cellulari umane, ma il dosaggio potrebbe essere adattato ad altre specie passando ad anticorpi per quella particolare specie. Inoltre, il metodo di analisi potrebbe essere utilizzato per qualsiasi applicazione intracellulare che richiede la co-localizzazioneDi tre sonde / marcatori.
The authors have nothing to disclose.
Vorrei ringraziare i miei colleghi a MilliporeSigma, Philip J. Morrissey e Sherree L. Friend, per il loro sostegno e la loro guida negli anni. Vorrei anche ringraziare Vidya Venkatachalam e Bryan R. Davidson per il loro aiuto con la funzionalità BDC3 nel software IDEAS , Ryan P. Jessup per contribuire a modificare questo manoscritto, Raymond Kong per aiuto nel giorno della ripresa e un ringraziamento speciale All'artista trucco Cynthia Xamonthiene.
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
AF647 labeled Donkey anti-Mouse – IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] – Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
DAPI Stain 5mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain—CAS-28718-90-3—Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10X | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
Earle's Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14155 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14175 | |
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
MIFC software – INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | HyClone | SV30082.1 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
Sodium Pyruvate solution (100mM) | HyClone | SH30239.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered—CAS-9002-93-1—Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |