Cardiac Spier Cell-gebaseerde Actuator en Zelfstabiliserende Biorobot - Deel 2
Summary
In deze studie worden een biologische actuator en een zelfstabiliserende zwemmende biorobot met gefunctionaliseerde elastomere cantilever armen geplant met cardiomyocyten, gekweekt en gekarakteriseerd voor hun biochemische en biomechanische eigenschappen in de tijd.
Abstract
In de afgelopen jaren zijn hybride apparaten die bestaan uit een levende cel of weefselcomponent, geïntegreerd met een synthetische mechanische ruggengraat, ontwikkeld. Deze apparaten, genaamd biorobots, worden alleen aangedreven door de kracht die voortvloeit uit de contractiele activiteit van het levende component en kan door hun vele inherente voordelen een alternatief zijn voor conventionele volledig kunstmatige robots. Hier beschrijven we de methoden om te zaaien en een biologische actuator en een biorobot te karakteriseren die is ontworpen, vervaardigd en gefunctionaliseerd in het eerste deel van dit tweedelig artikel. Geproduceerde biologische actuator en biorobotinrichtingen samengesteld uit een polydimethylsiloxaan (PDMS) basis en een dunne filmcantilever werden gefunctionaliseerd voor celbevestiging met fibronectine. Na de functionalisatie werden neonatale ratkardiomyocyten op een hoge dichtheid op de PDMS-cantileverarm gezaaid, wat resulteerde in een confluente celplaat. De apparaten werden elke dag afgebeeld en de beweging van de cantiHendel armen werden geanalyseerd. Op de tweede dag na het zaaien hebben we de buiging van de cantilever armen gezien als gevolg van de krachten die door de cellen werden uitgeoefend tijdens spontane samentrekkingen. Bij kwantitatieve analyse van het cantilever buigen werd een geleidelijke toename van de door de cellen uitgeoefende oppervlakspanning uitgeoefend, waarna ze over de tijd werden gerijpt. Evenzo hebben we de beweging van de biorobot waargenomen door de activering van de PDMS cantilever arm, die als een vink optrad. Bij kwantificering van de zwemprofielen van de toestellen werden verschillende voortstuwingswijzen waargenomen, die door de rusthoek van de vin beïnvloed werden. De bewegingsrichting en de klopfrequentie werden ook bepaald door de rusthoek van de vin en een maximale zwemsnelheid van 142 μm / s werd waargenomen. In dit manuscript beschrijven we de procedure voor het bevolken van de vervaardigde apparaten met cardiomyocyten, evenals voor de beoordeling van de biologische actuator en biorobotactiviteit.
Introduction
Biorobots zijn apparaten gebaseerd op levende cellen die zijn opgenomen in een mechanische ruggengraat die meestal bestaat uit zachte, elastische materialen, zoals PDMS of hydrogelen 1 . De cellen ondergaan ritmische contracties, hetzij spontaan of in reactie op stimuli, en functioneren dus als een actuator. De kracht die wordt gegenereerd door cellcontractie, rijdt op verschillende biorobots. Mammale hartcellen (cardiomyocyten) en skeletspiercellen worden vaak gebruikt voor biorobotactivering door hun contractiele eigenschappen. Afgezien van cardiomyocyt- en skeletspiercellen, zijn andere celsoorten, zoals insectespierweefsels 2 en geexplanteerde spierweefsels 3 , gebruikt. Insectspierweefsels maken de werking van biologische actuatoren bij kamertemperatuur mogelijk.
De functie en prestatie van een biorobot worden voornamelijk bepaald door de sterkte en consistentie van de biologische actuator ( dwz. Spiercellen), terwijl de mechanische ruggengraatstructuur voornamelijk de mechanismen van locomotie, stabiliteit en kracht bepaalt. Aangezien deze apparaten uitsluitend worden gedreven door krachten die door cellen worden gegenereerd, bestaan er geen chemische verontreinigende stoffen of bedieningsgeluiden. Daarom vormen ze een energie-efficiënt alternatief voor andere conventionele robots. Diverse literatuurbronnen hebben de verschillende methoden om levende cellen en weefsels in biorobots 1 , 4 , 5 te integreren besproken. Voorschotten in microfabricatie en weefseltechniek hebben de ontwikkeling van biorobots mogelijk gemaakt die kunnen lopen, grepen, zwemmen of pompen 5 , 6 . In het algemeen worden cellen rechtstreeks op de mechanische (polymere) ruggengraat gekweekt als een samenvloeiend celblad of worden ze gevormd in 3-dimensionale bedieningsstructuren binnen steigers zoals ringen en strips. Meestal zijn biorobotsVervaardigd met behulp van cardiomyocyt vellen 6 , 7 , aangezien deze cellen een aangeboren vermogen hebben om spontane samentrekking zonder externe stimuli te tonen. Aan de andere kant zijn rapporten over skeletspiercelbladen beperkt door hun behoefte aan stimuli om contracties in vitro te initiëren om de membraan depolarisatie 8 te starten.
Dit protocol beschrijft eerst hoe u kardiomyocyten op een functionele biologische actuator uit een dunne PDMS cantilever zaait. Het beschrijft vervolgens in detail de zaaien en analyseren van de zwemprofielen. De cantilever is gefunctionaliseerd met een cel kleefmiddel eiwit, zoals fibronectine en wordt samen met kardiomyocyten samengezaaid. Naarmate de cellen op het toestelcontract zaaien, veroorzaken ze dat de cantilever buigt en dus als een actuator optreedt. Na verloop van tijd, als de cellen volwassen worden, traceren we de veranderingen in de oppervlakspanning op het apparaat door video's van de video te analyserenCantilever buigen. De hier ontwikkelde biologische actuator kan worden gebruikt om de contractiele eigenschappen van elk celtype, zoals de fibroblasten of geïnduceerde pluripotente stamcellen, te bepalen, aangezien ze differentiëren ondergaan.
Veel van het vroegere onderzoek naar biorobots is gericht op het ontwikkelen van biologische actuatoren, terwijl de optimalisatie van de biorobotarchitectuur en functionele mogelijkheden grotendeels verwaarloosd was. Onlangs hebben enkele studies aangetoond dat de zwemmodi in biorobots geïmplementeerd zijn die door de natuur geïnspireerd zijn. Bijvoorbeeld, zwemmen biorobots met motionella op basis van flagella, kwallen 9 , en biohybrid stralen 4 zijn ontworpen. In tegenstelling tot andere werken in de literatuur, richten we hierbij op het variëren van de eigenschappen van de mechanische ruggengraat om een zelfstabiliserende structuur te creëren. De biorobot die in deze studie is ontwikkeld, kan een constante toonhoogte, rol en im behoudenMersion diepte als het zwemt. Deze parameters kunnen worden aangepast door de dikte van elk basiscomposiet te variëren. De fabricagestappen die betrokken zijn bij het ontwikkelen van de PDMS-actuator, de submergible biorobot en de functionalisatie van het apparaat worden in detail beschreven in Deel 1 van dit tweedelig artikel, evenals in ons recente werk 7. De hier ontwikkelde techniek kan de Manier voor de ontwikkeling van nieuwe, zeer efficiënte biorobots voor diverse toepassingen, zoals lading.
Het isolatieproces dat gevolgd wordt in deze studie is vergelijkbaar met het proces dat is beschreven in een eerder werk 10 , evenals in recentelijk gepubliceerd werk 7 . De microfabricatiemethoden die worden gebruikt voor het vervaardigen van de PDMS-actuatoren en biorobot-apparaten worden in detail beschreven in Deel 1 van dit tweedelige manuscript. Het protocol gedeelte van dit manuscript beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het zaaien van cardiomyocyten op de vervaardigde PDMS aCtuator en de biorobot na hun functionalisatie met cel kleef eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven procedure beschrijft een succesvolle zaaimethode voor PDMS-gebaseerde actuatoren en biorobots, die de bevestiging van cardiomyocyten vergemakkelijkt. Bovendien is het proces van beeldverwerving en de daaropvolgende analyse die het gedrag van de cellen karakteriseert en de prestatie van de apparaten beschreven.
We hebben na 24 uur spontane samentrekking van cellen op de cantileverarms waargenomen; De intensiteit van de contracties bleef mettertijd gestaag toenemen en bereik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MT Holley wordt ondersteund door het Graduate Fellows programma van het Louisiana Board of Regents, en C. Danielson wordt ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute Professors Programma. Deze studie wordt ondersteund door NSF Grant No: 1530884.
Materials
| Chemicals and reagents | |||
| Cardiomyocytes (primary cardiac cells) | Charles River | NA | Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats |
| Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate |
| Fetalclone III serum | Hyclone industries, GE | 16777-240 | Fetal bovin serum (FBS) |
| Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | Solution (1 mg/ml) |
| Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) | Molecular Probes | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Molecular Probes | F14217 | calcium indicator dye |
| Tyrodes salt solution | Sigma-Aldrich | T2397 | buffer solution |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P3000MP | nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO) |
| 16% Parafomaldehyde | Electron microscopy | 15710 | Caution: Irritant and combustible |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X-100 100 mL | cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) |
| ProLong gold antifade reagent | Molecular Probes | P10144 | Mounting agent |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes | A12381 | Actin filament marker |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | A-11012 | |
| pha | Molecular Probes | A-11001 | |
| Anti-connexin 43 antibody | Abcam | ab11370 | Gap junction marker |
| Anti-cardiac troponin I antibody | Abcam | ab10231 | Contractile protein |
| 16% EM grade paraformaldehyde solution | Electron microscopy | 100503-916 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Elsevier | Sylgard 184 | |
| Materials and Equipment | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| LED light strip | NA | NA | Any white LED without spectrum emission |
| Confocal microscope | Nikkon C2 | NA | Confocal microscope with three filter set. |
| Zooming lens | Infinity | Model# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | Used in Section 4) for biological actuator analysis. |
| Image J | National Institute of Health | NA | Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | Camera operating software |
References
- Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
- Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274 (2012).
- Herr, H., Dennis, R. G. A swimming robot actuated by living muscle tissue. J. NeuroEng Rehabil. 1, 6 (2004).
- Park, S., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 10125-10130 (2014).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab. Chip. 16, 3473-3484 (2016).
- Hopkins, P. M. Skeletal muscle physiology. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 6, 1-6 (2006).
- Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. JoVE. (79), e50154 (2013).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circ. Res. 87, 275-281 (2000).
- Shin, S. R., et al. Carbon-Nanotube-Embedded Hydrogel Sheets for Engineering Cardiac Constructs and Biological actuators. ACS Nano. 7, 2369-2380 (2013).
- Park, J., et al. Real-Time Measurement of the Contractile Forces of Self-Organized Cardiomyocytes on Hybrid Biopolymer Microcantilevers. Anal. Chem. 77, 6571-6580 (2005).
- Tamayo, J., et al. Quantification of the surface stress in microcantilever biosensors: revisiting Stoney’s equation. Nanotechnology. 23, 475702 (2012).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Methods. 10, 781-787 (2013).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in Cardiomyocyte Isolation, Culture, and Gene Transfer. J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 288-298 (2011).
- Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
- Sfakiotakis, M., Lane, D. M., Davies, J. B. C. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).
