भ्रूणीय एंजियोजेनेसिस के विज़ुअलाइज़ेशन और क्वांटिटेटिव विश्लेषण<em> ज़ीनोपस ट्रॉपिकलिस</em
Summary
यह प्रोटोकॉल vasculature कल्पना और क्सीनोपस उष्णकटिबंधीय में इसकी जटिलता का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति आधारित पद्धति को दर्शाता है । रक्त वाहिकाओं को फ्लोरोसेंट डाई के इंजेक्शन के बाद भ्रूण के हृदय के आनुवंशिक और / या औषधीय जोड़तोड़ के बाद हृदय में हृदय संबंधी विकास के अध्ययन के बाद मिनटों को इमेज किया जा सकता है ।
Abstract
रक्त वाहिकाओं पूरे शरीर में ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति करते हैं, और संवहनी नेटवर्क का गठन तंग विकास नियंत्रण के अंतर्गत होता है। रक्त वाहिकाओं के विवो दृश्यता में और उनकी जटिलता के विश्वसनीय मात्रा का ठहराव, नाड़ी नेटवर्क के जीव विज्ञान और बीमारी को समझने में महत्वपूर्ण है। यहां, हम एक विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं जो रक्त वाहिकाओं को वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट डाई, मानव प्लाज्मा एसिटाइटेड कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन डीआई कॉम्प्लेक्स (डीआईआई-एसीडीएल) के साथ कल्पना करते हैं, और क्सीनोपस ट्रॉपिकल में उनकी जटिलता का पता लगाने के लिए प्रदान करते हैं । रक्त वाहिकाओं को डीआईआई- एसीडीएल के एक सरल इंजेक्शन द्वारा भ्रूण के पिटाई दिल में लेबल किया जा सकता है, और पूरे भ्रूण में रक्त वाहिकाओं को जीवित या निश्चित भ्रूण में चित्रित किया जा सकता है। न्यूक्लिक एसिड के लक्षित microinjection और / या औषधीय अभिकर्मकों के स्नान आवेदन द्वारा जीन गड़बड़ी के साथ संयुक्त, एक जीन की भूमिका या नाड़ी के विकास पर एक सिग्नलिंग मार्ग हो सकता हैपरिष्कृत आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जानवरों का सहारा लेने के बिना एक सप्ताह के भीतर शर्मिंदा Xenopus और इसकी स्टीरियोटाइपिक एंजियोजेनेसिस की अच्छी तरह से परिभाषित श्वासनलिका प्रणाली के कारण, पूर्व-मौजूदा जहाजों के अंकुरण, पोत जटिलता को गड़बड़ी प्रयोगों के बाद कुशलतापूर्वक मापा जा सकता है। यह अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल कार्डियोवास्कुलर अनुसंधान के विविध क्षेत्रों में एक आसानी से सुलभ उपकरण के रूप में सेवा करना चाहिए।
Introduction
Vasculogenesis, नवजात जन्मजात कोशिकाओं से नए रक्त वाहिकाओं का निर्माण, और एंजियोजेनेसिस, पूर्व-मौजूदा जहाजों से नए जहाजों का गठन, दो अलग-अलग प्रक्रियाएं हैं जो कि भ्रूण वास्क्यूचर 1 को आकार देते हैं। इन प्रक्रियाओं में किसी भी प्रकार के अभाव में विभिन्न हृदय रोगों और जहाजों की संरचनात्मक असामान्यताएं होती हैं। इसके अलावा, ट्यूमर के विकास अनियंत्रित पोत विकास के साथ जुड़ा हुआ है जैसे, वास्कुलोजेनेसिस और एंजियोजेनेसिस के अंतर्गत आणविक तंत्र, तीव्र जांच का विषय है 2 ।
ज़िनोपस और ज़ेबराफिश, कई कारणों से vasculogenesis और angiogenesis अध्ययनों के लिए आकर्षक वर्टेब्रेट मॉडल हैं। सबसे पहले, उनके भ्रूण छोटे होते हैं; इसलिए, यह छवि के लिए अपेक्षाकृत आसान है, पूरे वास्कुलचर। दूसरा, भ्रूण विकास तेजी से होता है; यह केवल पूरे vasculature के विकास के लिए कुछ दिनों का समय लेता है, जिसके दौरान विकासशील कोशिकाएं अचरण इमेजेट किया जा सकता है तीसरा, पोषक संरचना के पहले और दौरान, आनुवंशिक और औषधीय हस्तक्षेप करना आसान है, जैसे कि एंटीसेन्स मोर्फोलिनो न्यूक्लियोटाइड (एमओ) के विकासशील भ्रूण में या 3 , 4 , 5 दवाओं के स्नान आवेदन के माध्यम से।
ज़ेब्राफिश पर ज़ीनोपस का अनूठा लाभ यह है कि भ्रूण-संबंधी जोड़-तोड़ें इसलिए की जा सकती हैं क्योंकि ज़िनोपस टकसाली होलोब्लास्टिक क्लीवेज का अनुसरण करता है और भ्रूण भाग्य का नक्शा अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है। उदाहरण के लिए, एक भ्रूण पैदा करना संभव है जिसमें दो कोशिकाओं के एक कोशिका में दो कोशिकाओं के एक एंटीज़ेंस एमओ द्वारा इंजेक्शन लगाने से आनुवंशिक रूप से केवल एक पार्श्व की ओर बढ़ जाती है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या जीन एक सेल-आंतरिक या -परिर्सेज तंत्र द्वारा अपने कार्य को सक्रिय करता है या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए हृदय प्रापर्टीज को एक भ्रूण से दूसरे स्थान पर ट्रांसप्लांट करना भी संभव हैAss = "xref"> 7 यद्यपि इन तकनीकों को ज्यादातर ज़िनोपस लाईविस में विकसित किया गया है, जो कि ऑलोटेट्राप्लाइड है और इसलिए आनुवंशिक अध्ययनों के लिए आदर्श नहीं है, उन्हें सीधे Xenopus tropicalis , एक बारीकी से संबंधित द्विगुणित प्रजातियों 8 पर लागू किया जा सकता है।
जीवित Xenopus भ्रूण में vasculature की कल्पना करने का एक तरीका रक्त वाहिकाओं को लेबल करने के लिए एक फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्ट करना है। डीआईआई जैसे फ्लोरोसेंट अणु के साथ लेबल एसिटिलेटेड कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एसीएलडीएल) एक बहुत ही उपयोगी जांच है। अप्रभावी एलडीएल के विपरीत, एसीएलडीएल एलडीएल रिसेप्टर 9 से जुड़ा नहीं है, लेकिन मैक्रोफेज और एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा एन्डोकिटेट किया गया है। डीआईआई-एसीडीएल का इंजेक्शन एक जीवित प्राणियों के परिणाम में एंडोथेलियल कोशिकाओं के विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग में होता है, और पूरे vasculature को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव या निश्चित भ्रूण 4 में इमेज किया जा सकता है।
यहाँ, हम presXenopus tropicalis ( चित्रा 1 ) में DiI-AcLDL का उपयोग कर रक्त वाहिकाओं के दृश्य और मात्रा का ठहराव के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल। हम महत्वपूर्ण व्यावहारिक बिंदुएं प्रदान करते हैं, सफल और असफल प्रयोगों के उदाहरणों के साथ। इसके अलावा, हम संवहनी जटिलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक सीधा तरीका प्रदान करते हैं, जो संवहनी नेटवर्क के आकार पर आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों के प्रभावों का आकलन करने में उपयोगी हो सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सबसे पहले अली एच। बिर्वनलोउ और उनके सहयोगियों द्वारा एक्सनोपस लाईविस 4 में संवहनी गठन के दौरान विकास संबंधी घटनाओं की जांच के लिए विकसित किया गया था, लेकिन जैसा कि इस ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को लेविन एट अल के काम से प्रेरित किया गया था । , जो इस प्रयोगात्मक विधि का वर्णन करता है और ज़िनोपस लाईविस में संवहनी विकास का एक व्यापक वर्णन प्रदान करता है । हम अपने इनपुट के लिए हमारी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को 2015 के 2015 (2015-22-00 9) के योनेसी विश्वविद्यालय के भविष्य के अग्रणी अनुसंधान पहल और विज्ञान, आईसीटी और भविष्य नियोजन मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के जैव एवं चिकित्सा प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
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