Summary

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em> Xenopus tropicalis</em

Published: May 25, 2017
doi:

Summary

Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.

Abstract

Bloedvaten leveren zuurstof en voedingsstoffen door het hele lichaam, en de vorming van het vaatnetwerk is onder strakke ontwikkelingsregeling. De efficiënte in vivo visualisatie van bloedvaten en de betrouwbare kwantificering van hun complexiteit zijn essentieel voor het begrijpen van de biologie en ziekte van het vaatnetwerk. Hier geven we een gedetailleerde methode om bloedvaten te visualiseren met een in de handel verkrijgbare fluorescerende kleurstof, menselijk plasma geacetyleerd laagdichtheid lipoproteïne DiI complex (DiI-AcLDL) en om hun complexiteit te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen worden gemerkt door een eenvoudige injectie van DiI-AcLDL in het kloppende hart van een embryo, en bloedvaten in het hele embryo kunnen worden afgebeeld in levende of vaste embryo's. Gecombineerd met genstoornis door de gerichte microinjectie van nucleïnezuren en / of de badtoepassing van farmacologische reagentia, kunnen de rollen van een gen of van een signaalweg op vasculaire ontwikkeling in vivo zijnBinnen een week gestegen zonder aan te vullen tot geavanceerde genetisch gemanipuleerde dieren. Vanwege het goed gedefinieerde veneuze systeem van Xenopus en zijn stereotiepe angiogenese kan het spruiten van bestaande vaten, vatencomplexiteit efficiënt worden gekwantificeerd na verstoringsexperimenten. Dit relatief eenvoudige protocol dient als een gemakkelijk toegankelijk instrument op diverse gebieden van cardiovasculair onderzoek.

Introduction

Vasculogenese, de vorming van nieuwe bloedvaten uit pasgeboren endotheelcellen, en angiogenese, de vorming van nieuwe vaten uit bestaande vaten, zijn twee verschillende processen die de embryonale vasculatuur vormen 1 . Elke dysregulatie bij deze processen resulteert in verschillende hartziekten en structurele abnormaliteiten van vaten. Bovendien is tumorgroei geassocieerd met onbeheerde vatengroei. Als zodanig zijn moleculaire mechanismen die onderliggend zijn aan vasculogenese en angiogenese het onderwerp van intensief onderzoek 2 .

Xenopus en zebravis zijn aantrekkelijke gewervelde modellen voor vasculogenese en angiogenese studies, om verschillende redenen. Ten eerste zijn hun embryo's klein; Daarom is het relatief eenvoudig om de hele vasculatuur te bekijken. Ten tweede is embryonale ontwikkeling snel; Het duurt slechts een paar dagen voor de gehele vasculatuur om te ontwikkelen, gedurende welke periode het ontwikkelende vaatje ontwikkelt Ature kan worden afgebeeld. Ten derde zijn genetische en farmacologische interventies voor en tijdens het vatenvorming makkelijk te verrichten, zoals door middel van microinjectie van antisense morfolino nucleotiden (MO's) in het ontwikkelende embryo of door de badtoepassing van drugs 3 , 4 , 5 .

Het unieke voordeel van Xenopus over zebravis is dat embryologische manipulaties kunnen worden uitgevoerd omdat Xenopus stereotiepe holoblastische splitsingen volgt en de embryonale lotkaart is goed gedefinieerd 6 . Bijvoorbeeld, het is mogelijk om een ​​embryo te genereren waarin slechts één zijdelingse zijde genetisch gemanipuleerd wordt door een antisense MO te injecteren naar een cel in het twee-cel stadium. Het is ook mogelijk om het hartprimordium van een embryo naar een ander te transplanteren om te bepalen of het gen zijn functie uitoefent door een cel-intrinsiek of -xtrinsiek mechanismeAss = "xref"> 7. Hoewel deze technieken meestal zijn ontwikkeld in Xenopus laevis , die allotetraploïde is en daarom niet ideaal is voor genetische studies, kunnen ze direct toegepast worden op Xenopus tropicalis , een nauw verwante diploïde soort 8 .

Een manier om de vasculatuur in een levend Xenopus embryo te visualiseren, is om een ​​fluorescerende kleurstof te injecteren om de bloedvaten te labelen. Geacetyleerde laagdichtheidslipoproteïne (AcLDL) gemerkt met een fluorescerend molecuul zoals DiI is een zeer bruikbare sonde. In tegenstelling tot niet-geacetylleerde LDL bindt AcLDL niet aan de LDL-receptor 9 maar wordt endocytose door macrofagen en endothelcellen. De injectie van DiI-AcLDL in het hart van een levend dier resulteert in de specifieke fluorescerende etikettering van endotheelcellen, en de gehele vasculatuur kan worden afgebeeld door fluorescentiemicroscopie in levende of vaste embryo's 4 .

Hier preseren weGedetailleerde protocollen voor het visualiseren en kwantificeren van bloedvaten met behulp van DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Figuur 1 ). Wij leveren belangrijke praktische punten, met voorbeelden van succesvolle en mislukte experimenten. Daarnaast bieden we een eenvoudige methode voor de kwantitatieve analyse van vasculaire complexiteit, die nuttig kan zijn bij de beoordeling van de effecten van genetische en omgevingsfactoren op het vormen van het vaatnetwerk.

Protocol

Alle experimenten voldoen aan protocollen die zijn goedgekeurd door de Yonsei University College of Medicine Institutionele Diervoeder- en Gebruikscommissies. 1. Bereiding van xenopus tropicalis embryo's OPMERKING : Xenopus tropicalis embryo's werden geproduceerd zoals eerder beschreven 10 , met lichte wijziging. Xenopus tropicalis embryo's werden georganiseerd volgens de tabellen van Nieuwkoop en Faber <sup class=…

Representative Results

Tijdlijn van experimenten (figuren 1 en 2) Kort na bevruchting kan gerichte microinjectie worden uitgevoerd om genuitdrukking te moduleren. Bijvoorbeeld kan een antisense MO die specifiek bindt aan het initiatiecodon van het endogene Tie2-mRNA geïnjecteerd worden, waardoor de translatie van Tie2-target-mRNA door sterische belemmering wordt geremd. Een MO kan worden geconjugeerd met fluoresceïne voor het makkelijk visuele screen…

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol werd eerst ontwikkeld door Ali H. Brivanlou en collega's om ontwikkelingsgebeurtenissen tijdens vasculaire vorming in Xenopus laevis 4 te onderzoeken, maar zoals getoond in dit manuscript, kan deze toegepast worden op andere kleine dieren. Dye injectie in het hart is eenvoudig uit te voeren, en het gehele vasculaire netwerk kan worden afgebeeld onder een fluorescentiedissectiemicroscoop, evenals een confocale microscoop. Als de kleurstof in het hart w…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd geïnspireerd door het werk van Levine et al. , Die deze experimentele methode beschreven en een uitgebreide beschrijving van de vaatontwikkeling in Xenopus laevis gaf . Wij danken de leden van ons laboratorium voor hun input. Deze studie werd ondersteund door het Yonsei University Future-Leading Research Initiative van 2015 (2015-22- 0095) en het Bio & Medical Technology Development Program van de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomstige planning ( NRF-2013M3A9D5072551)

Materials

35mm Petri dish SPL 10035 Sylgard mold frame
60mm Petri dish SPL 10060 Embryo raising tray
Borosilicate Glass Sutter instrument B100-50-10 Needle for injection
BSA Sigma A3059-10G Coating reagent
CaCl2 D.S.P.GR Reagent 0.1X MBS component
Coverslip Superior HSU-0111520 For confocal imaging
DiI-AcLDL Thermo Fisher Scientific L3484 Vessel staining solution
FBS Hyclone SH.30919.02 For storage of testis
Fiber Optical Illuminator World Precision Instruments Z-LITE-Z Light
Ficoll Sigma F4375 Injection buffer
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter instrument P-97 Injection needle puller
Forcep Fine Science Tool 11255-20 For embryo hatching and
needle tip cutting
Glass Bottom dish SPL 100350 For confocal imaging
hCG MNS Korea For priming of frogs
HEPES Sigma H3375 Buffering agent
Incubator Lab. Companion ILP-02 For raising embryos
KCl DAEJUNG 6566-4400 MBS component
L15 medium Gibco 11415-114 For storage of testis
L-cysteine Sigma 168149-100G De-jellying reagent
MgSO4 Sigma M7506 MBS component
Microtube Axygen MCT-175-C-S For storage of testis
MS222 Sigma E10521 Anesthetic powder
NaCl DAEJUNG 7647-14-5 MBS component
NaOH Sigma S-0899 pH adjusting reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Fixatives
PBS BIOSESANG P2007 Buffer for imaging
pH paper Sigma P4536-100EA For confirming pH
PICO-LITER INJECTOR Waner instruments PLI-100A For injection
Pin Pinservice 26002-10 For incision
Pinholder Scitech Korea 26016-12 For incision
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope World Precision Instruments PZMIII For visual screening
Standard Manual Control Micromanipulator  Waner instruments W4 64-0056 For microinjection
SYLGARD 184 Kit Dow Corning For DiI injection
Transfer pipette Korea Ace Scientific Co. YM.B78-400 For eggs and
embryo collection

References

  1. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
  2. Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
  3. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
  4. Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
  5. Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
  6. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  7. Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
  8. Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
  9. Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
  10. Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
  12. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  13. Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
  14. Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
  15. Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
  16. Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
  17. Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).

Play Video

Cite This Article
Ohk, J., Jung, H. Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis. J. Vis. Exp. (123), e55652, doi:10.3791/55652 (2017).

View Video