Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em> Xenopus tropicalis</em
Summary
Detta protokoll demonstrerar en fluorescensbaserad metod för att visualisera vasculaturen och att kvantifiera dess komplexitet i Xenopus tropicalis . Blodkärl kan avbildas efter en injektion av ett fluorescerande färgämne i ett embryos slagande hjärta efter genetisk och / eller farmakologisk manipulation för att studera kardiovaskulär utveckling in vivo .
Abstract
Blodkärl levererar syre och näringsämnen genom hela kroppen, och bildandet av det vaskulära nätverket är under stram utvecklingskontroll. Den effektiva in vivo- visualiseringen av blodkärl och tillförlitlig kvantifiering av deras komplexitet är nyckeln till förståelse av biologin och sjukdomen i det vaskulära nätverket. Här tillhandahåller vi en detaljerad metod för att visualisera blodkärl med ett kommersiellt tillgängligt fluorescerande färgämne, humant plasma acetylerat lågdensitetslipoprotein DiI-komplex (DiI-AcLDL) och för att kvantifiera deras komplexitet i Xenopus tropicalis . Blodkärl kan märkas genom en enkel injektion av DiI-AcLDL i ett embryos slagande hjärta, och blodkärl i hela embryot kan avbildas i levande eller fasta embryon. Kombinerad med genstörning genom den riktade mikroinjektionen av nukleinsyror och / eller badapplikationen av farmakologiska reagenser kan en gens eller en signalvägs rörelser på vaskulär utveckling vara inveStigit inom en vecka utan att tillgripa sofistikerade genetiskt manipulerade djur. På grund av det väldefinierade venösa systemet för Xenopus och dess stereotypa angiogenes kan spridningen av befintliga kärl, kärlekomplexitet kvantifieras effektivt efter störningsförsök. Detta relativt enkla protokoll bör fungera som ett lättillgängligt verktyg inom olika områden inom kardiovaskulär forskning.
Introduction
Vaskulogenes, bildandet av nya blodkärl från nyfödda endotelceller och angiogenes, bildandet av nya kärl från befintliga kärl, är två separata processer som formar embryonisk kärl 1 . Eventuell dysregulering i dessa processer resulterar i olika hjärtsjukdomar och strukturella abnormiteter hos kärl. Vidare är tumörtillväxt associerad med okontrollerad kärltillväxt. Som sådan är molekylära mekanismer som ligger bakom vaskulogenes och angiogenes föremål för intensiv utredning 2 .
Xenopus och zebrafisk är attraktiva ryggradsmodeller för vaskulogenes och angiogenesstudier av flera skäl. Först är deras embryon små; Därför är det relativt lätt att bilda hela kärlsystemet. För det andra är embryonal utveckling snabb; Det tar bara ett par dagar för hela kärlsystemet att utvecklas, under vilken tid den utvecklas vascul Ature kan avbildas. För det tredje är genetiska och farmakologiska ingrepp före och under kärlbildning lätt att utföra, såsom genom mikroinjektion av antisensmorfolino-nukleotider (MO) i det utvecklande embryot eller genom badapplikationen av läkemedel 3 , 4 , 5 .
Den unika fördelen med Xenopus över zebrafisk är att embryologiska manipuleringar kan utföras, eftersom Xenopus följer stereotypa holoblastiska klyvningar och den embryonska ödet kartan är väldefinierad 6 . Det är till exempel möjligt att generera ett embryo där endast en sidosida är genetiskt manipulerad genom att injicera en antisens MO till en cell i tvåcellssteget. Det är också möjligt att transplantera hjärtprimordet från ett embryo till ett annat för att bestämma huruvida genen utövar sin funktion av en cellinriktad eller -xtrinsisk mekanismRöv = "xref"> 7. Även om dessa tekniker främst har utvecklats i Xenopus laevis , som är allotetraploid och därför inte är idealisk för genetiska studier, kan de direkt appliceras på Xenopus tropicalis , en närstående diploidart 8 .
Ett sätt att visualisera vasculaturen i ett levande Xenopus- embryo är att injicera ett fluorescerande färgämne för att märka blodkärlen. Acetylerat lågdensitetslipoprotein (AcLDL) märkt med en fluorescerande molekyl såsom DiI är en mycket användbar sond. Till skillnad från oacetylerad LDL binds inte AcLDL till LDL-receptorn 9 men endocytoseras av makrofager och endotelceller. Injektionen av DiI-AcLDL i hjärtat av ett levande djur resulterar i den specifika fluorescensmärkningen av endotelceller, och hela kärlsystemet kan avbildas genom fluorescensmikroskopi i levande eller fasta embryon 4 .
Här presar viEnt detaljerade protokoll för visualisering och kvantifiering av blodkärl med användning av DiI-AcLDL i Xenopus tropicalis ( Figur 1 ). Vi tillhandahåller viktiga praktiska punkter, med exempel på framgångsrika och misslyckade experiment. Dessutom ger vi en enkel metod för kvantitativ analys av vaskulär komplexitet, vilket kan vara användbart vid bedömning av effekterna av genetiska och miljömässiga faktorer vid utformningen av det vaskulära nätverket.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som presenteras här utvecklades först av Ali H. Brivanlou och kollegor för att undersöka utvecklingshändelser under kärlbildning i Xenopus laevis 4 , men som det kan visas i detta manuskript kan det tillämpas på andra små djur. Färginsprutning i hjärtat är enkelt att utföra, och hela kärlsystemet kan avbildas under ett fluorescensdissektionsmikroskop, såväl som ett konfokalt mikroskop. Om färgämnet injiceras i hjärtat under fartygsutveckling kan dynamiken i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie inspirerades av Levine et al. , Som beskrev denna experimentella metod och gav en omfattande beskrivning av vaskulär utveckling i Xenopus laevis. Vi tackar medlemmarna i vårt laboratorium för deras inmatning. Den här studien stöddes av Yonsei Universitets framtidsledande forskningsinitiativ från 2015 (2015-22- 0095) och National Research Foundation (NRF) Bio & Medical Technology Development Program finansierat av ministeriet för vetenskap, IKT och framtidsplanering ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
