Summary
Presentiamo una soluzione software per il monitoraggio semi-automatico della concentrazione proteica relativa lungo la lunghezza delle protuberanze cellulari dinamiche.
Abstract
Le filopodie sono dinamiche, protrusioni cellulari simili a dito associate alla migrazione e alla comunicazione cellulare. Per comprendere meglio i complessi meccanismi di segnalazione sottostanti all'iniziazione filosofica, all'allungamento e alla successiva stabilizzazione o ritrazione, è fondamentale determinare l'attività proteica spazi-temporale in queste strutture dinamiche. Per analizzare la funzione proteica in filopodi, abbiamo recentemente sviluppato un algoritmo semi-automatizzato di tracciamento che si adatta a cambiamenti di forma filopodiale consentendo così un'analisi parallela delle dinamiche di protrusione e della concentrazione di proteine relative lungo tutta la lunghezza filopodiale. Qui presentiamo un dettagliato protocollo dettagliato per la gestione delle celle ottimizzate, l'acquisizione di immagini e l'analisi del software. Inoltre forniamo istruzioni per l'utilizzo delle funzioni opzionali durante l'analisi delle immagini e la rappresentazione dei dati, nonché le linee guida per la risoluzione dei problemi per tutti i passaggi critici lungo la strada. Infine, includiamo anche un confronto del dSoftware di analisi di immagini escribed con altri programmi disponibili per la quantificazione filopodia. Insieme, il protocollo presentato fornisce un quadro per un'analisi accurata delle dinamiche proteiche nelle protuberanze filopodiali usando il software di analisi delle immagini.
Introduction
Il controllo spazio-temporale delle proteine regolatrici dell'atina è associato alla dinamica dei filopodium 1 , 2 . Il monitoraggio della concentrazione proteica spazialmente risolto lungo tutta la lunghezza filopodiale nel tempo è quindi cruciale per favorire la comprensione dei meccanismi che sottendono l'iniziazione, l'allungamento, la stabilizzazione o il crollo di queste strutture dinamiche 3 , 4 . A differenza dell'analisi proteica nel citosolo, in cui si verificano molteplici cambiamenti di forma cellulare in una scala più ampia, le filopodie sono microstrutture dinamiche che costantemente stringono 5 e si curvano, evitando così l'analisi utilizzando un approccio semplice come una scansione di linea.
Diverse soluzioni software per il monitoraggio della forma filopodiale sono disponibili 6 , 7 , 8 , 9 . LikewÈ stato sviluppato software per il tracking ratiometrico delle dinamiche proteiche all'interno del corpo cellulare 10 , 11 . Per combinare il monitoraggio automatizzato della forma filopodiale e dell'analisi proteica spaziometrica, abbiamo recentemente sviluppato un software di analisi delle immagini basato sull'algoritmo convesso 12 . Questo nuovo metodo di analisi, gestito tramite un'interfaccia grafica (GUI), combina per la prima volta la concentrazione di proteine relativa lungo la lunghezza filopodiale e la velocità di crescita, consentendo così la misurazione accurata della distribuzione proteica spazi-temporale indipendente dal movimento di queste Strutture dinamiche 12 .
L'idea dietro il software (codice sorgente è liberamente disponibile, vedi sotto) è che uno dei vertici dello scafo convesso coinciderà con la punta del filopodium ( Figura 1A ). Guardando nella cornice successivaR il vertice più vicino dello scafo convesso, la punta in movimento può essere tracciata in tutto il filmato. Una volta che la punta viene rilevata in ogni telaio, la sua posizione viene usata per disegnare un asse unendosi alla punta con un punto di riferimento alla base del filopodium ( figura 1B ). Infine, usando punti nodali equidistanti, le cui posizioni sono determinate dal pixel mediano con intensità massima lungo la linea ortogonale all'asse, vengono utilizzati per determinare una spina dorsale che segue la forma filopodiale. Approfittando di questa base adattativa, viene generato un kymograph per tracciare la crescita filopodiale e le concentrazioni proteiche per un massimo di tre canali lungo la lunghezza filopodiale ( Figura 1C ).
Figura 1: Principio di funzionamento del software di analisi delle immagini. ( A ) L'algoritmo dietroil software. In Step1 l'utente specifica il riferimento (base) e il vertice (la punta) del filopodium. Nel passaggio 2-1 si ottiene la spina dorsale del filopodium usando il pixel mediano con il valore massimo di intensità. Nel passaggio 3 la spina dorsale è utilizzata per il profilo di intensità proteica spaziale. Nel passaggio 2-2 il software segue automaticamente la punta nel fotogramma successivo. L'intera procedura si estende. ( B ) Snapshot dell'algoritmo con filopodium reale introducendo elementi importanti come lo scafo convesso che viene utilizzato per il tracciamento. ( C ) Panoramica dei parametri che possono essere misurati con l'algoritmo. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 12 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il software di analisi delle immagini viene utilizzato in Matlab (indicato come software di programmazione) tramite un uso graficoR interfaccia. Per massimizzare la flessibilità e la robustezza per la particolare impostazione sperimentale, l'utente può regolare una serie di parametri di tracciamento ( ad esempio l'angolo di flusso consentito e il movimento inter-frame) e anche fare alcune correzioni ai filmati ( ad es. Ritaglio, rotazione, rimozione di oggetti indesiderati) ( Figura 2A e Tabella 1) .
| GUI | No. | Obbligatorio | Descrizione | Nome (in GUI) | ||||
| # 1 | 1a | Y | Caricare un file .tiff impilato che rappresenta il corpo cellulare (con casella controllata) o crea un corpo cellulare sovrapposto dai canali | Corpo cellulare | ||||
| # 1 | 1b | Y | Proteina 1 | |||||
| # 1 | 1c | Y | Caricamento di un file di immagine impilato corrispondente alla proteina 2 | Proteina 2 | ||||
| # 1 | 1d | Y | Caricare il file di immagine sovrapposto alla proteina 3 | Proteina 3 | ||||
| # 1 | 1e | N | Ripristina tutti i file di immagine impilati precaricati | Reset | ||||
| # 1 | 2a | Y | Barra di scorrimento per determinare il frame iniziale per l'analisi nella finestra GUI # 2 | N / A | ||||
| # 1 | 2b | Y | Barra di scorrimento per determinare il frame finale per l'analisi nella finestra GUI # 2 | N / A | ||||
| # 1 | 2c | Y | Barra di scorrimento che rappresenta la curraNt frame | N / A | ||||
| # 1 | 2d | N | Il valore grigio dei pixel al di sotto di cui tutti i pixel saranno impostati su zero | N / A | ||||
| # 1 | 2e | N | Il valore grigio dei pixel al di sopra del quale tutti i pixel saranno impostati sui valori massimi | N / A | ||||
| # 1 | 2f | N | Impostare i valori di intensità dei pixel specificati da <2e> e <2f> | Impostato | ||||
| # 1 | 2g | N | Riprodurre il filmato regolato dall'intensità | Giocare | ||||
| # 1 | 2h | N | Ritaglia l'immagine | raccolto | ||||
| # 1 | 2i | N | Ruota l'immagine | Ruotare | ||||
| # 1 | 2J | N | Cancellare le regioni in tutta la pila | Elimina regioni | ||||
| # 1 | 3a | Y | Fare clic per aprire la finestra di analisi (finestra GUI # 2) | Finestra di monitoraggio | ||||
| # 1 | 3b | Y | Immettere le dimensioni di un pixel in micron | Inserisci dimensione pixel | ||||
| # 2 | 4 | Y | Fare clic per generare l'immagine del bordo / bordo del corpo cellulare sovrapposto | Confine | ||||
| # 2 | 5 | Y | Clicca per selezionare la base e la punta della filopodia | Referernce | ||||
| # 2 | 6a | Y | Inserisci il numero di segmenti o nodi | No di segmenti | ||||
| # 2 | 6b | Y | Inserisci la lunghezza della scansione (perpendicolare all'asse) | Larghezza di scansione | ||||
| # 2 | 6c | Y | Immettere la lunghezza sopra la quale filopodia inizia a piegarsi | Accurate misura dopo | ||||
| # 2 | 6d | Y | Inserisci il raggio del cerchio di rilevamento della punta (ovvero l'area in cui il vertice può essere localizzato nel fotogramma successivo) | Raggio di rilevamento delle punte | ||||
| # 2 | 6e | Y | Inserisci l'angolo massimo che il filopodium può piegarsi dall'asse verticale | Soglia di angolo | ||||
| # 2 | 6f | N | Aggiungere punti di riferimento per la base e la punta per quella specifica cornice | Seleziona il riferimento | ||||
| # 2 | 6g | N | Immettere la lunghezza sopra la quale filopodia inizia a piegarsi per quel particolare fotogramma | Accurate misura dopo | ||||
| # 2 | <td> 6hN | Inserisci il raggio del cerchio di rilevamento per quel fotogramma specifico | Raggio di rilevamento delle punte | |||||
| # 2 | 6i | N | Dopo aver inserito tutti i parametri per il frame specifico cliccare per memorizzare i valori in memoria e file per ulteriori riferimenti | Inserisci | ||||
| # 2 | 6j | N | Fare clic per eliminare i parametri impostati manualmente per quel fotogramma | Elimina | ||||
| # 2 | 6K | N | Fare clic per eliminare tutti i parametri memorizzati manualmente utilizzando il pannello delle funzioni opzionali per tutti i fotogrammi | Reset | ||||
| # 2 | 6L | N | Accedere prima del monitoraggio per memorizzare tutti i risultati di monitoraggio in memoria per futuri riferimenti | Traccia di storia | ||||
| # 2 | 7 | Y | Fai clic per avviare il tracciamento | Traccia e Analisi | ||||
| # 2 | 8a | N | Fai clic per iniziare a monitorare l'intensità del canale proteico | Analizzare le intensità proteiche | ||||
| # 2 | 8b | N | Entra per monitorare l'intensità del canale proteico lungo la lunghezza filopodiale | Tutta la filopodia | ||||
| # 2 | 8c | N | Entra per il monitoraggio della proteina o della proteina di riferimento A | proteína | ||||
| # 2 | 8d | N | Entra per il monitoraggio della proteina B | ProteinB | ||||
| # 2 | 8e | N | Entra per il monitoraggio della proteina C | ProteinC | ||||
| # 2 | 8f | N | Entra per tenere traccia dell'intensità media della proteina in thE punta | Punta dirigente | ||||
| # 2 | 8g | N | Inserire la lunghezza della punta | Tip Lunghezza | ||||
| # 2 | 8h | N | Immettere la distanza minima dalla base sopra la quale la punta comincia a formarsi | soglia | ||||
| # 2 | 8i | N | Fare clic per salvare i risultati principali dell'analisi dei suggerimenti in file | Premi il bottone | ||||
| # 2 | 9a | N | Fare clic per avviare analisi proteometrica delle proteine | Confrontare | ||||
| # 2 | 9b | N | Controlla per confrontare la proteina B rispetto a A | log10 (B / A) | ||||
| # 2 | 9c | N | Controlla per confrontare la proteina C rispetto a A | log10 (C / A) | ||||
| # 2 | <td> 9dN | Controlla per confrontare la proteina B rispetto a A alla punta | log10 (B / A) | |||||
| # 2 | 9e | N | Controlla per confrontare la proteina C rispetto a A alla punta | log10 (C / A) | ||||
| # 2 | 10a | N | Scegli un'altra mappa a colori (impostazione predefinita: Jetplot) | Mappa del colore | ||||
| # 2 | 10b | N | Modifica la colormap | Modifica colormap | ||||
Tabella 1: Panoramica di tutte le funzioni presenti nella GUI Windows # 1 e # 2.
Una volta raggiunto questo obiettivo, il programma crea uno scafo convesso e traccia automaticamente la punta in tutto il filmato. Parametri estratti dal film, come un kymograph ratiometrico, velocità di crescita e lunghezza filopodiale aVengono visualizzati e memorizzati nella cartella di lavoro come immagini e come file di dati. Possono poi essere estratti altri parametri, come la durata della vita filopodiale, la velocità di crescita e la frequenza di ritiro e vengono ulteriormente analizzati dai file di dati memorizzati ( Figura 2B ).
Figura 2: Interfaccia grafica utente per l'utilizzo del software di analisi delle immagini. ( A ) La finestra # 1 della GUI viene utilizzata per il caricamento e l'elaborazione di immagini. Il programma può caricare fino a 3 canali proteici, per cui 2 canali vengono confrontati in coppia. La finestra viene fornita con le funzioni obbligatorie (blu) e facoltative (verde) per la pre-elaborazione delle immagini prima della tracciabilità ( B ) La finestra # 2 della GUI viene utilizzata per il monitoraggio dell'analisi della proteina filopodica e spaziometrica e rapporto-metrica. Ancora una volta, le caratteristiche facoltative sono contrassegnate in verde. Questa cifra è stata modificataDal riferimento 12 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione del campione e la gestione del software. Iniziamo con istruzioni dettagliate sulle cellule di coltura e l'acquisizione di filmati ottimizzati per l'analisi delle immagini. Questa sezione relativa all'acquisizione dati è seguita da una descrizione dettagliata per l'utilizzo del software di analisi delle immagini. Durante tutto il protocollo, vengono introdotti passi critici e funzionalità opzionali che dovrebbero essere considerate durante la raccolta e l'elaborazione dei dati. Infine, analizziamo filopodi da diversi sistemi di modello con il software di analisi delle immagini, prima di chiudere con un confronto del software di analisi delle immagini descritto con altri programmi disponibili per la quantificazione filopodiale e una discussione sulle limitazioni e la direzione futura.
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Protocol
1. Cultura cellulare
- Coltura le cellule HeLa o COS nel mezzo modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 g / L D-glucosio, L-alanina-L-glutammina di dipeptide, piruvato, 10% siero fetale bovino e 10 unità / ml di penicillina / streptomicina. Neuroni di cultura in supporti di coltura senza L-glutamina, acido glutammico o acido aspartico, integrati da 0,5 mM dipeptide L-alanina-L-glutammina, supplementi neuronali privi di siero e 10 unità / ml di penicillina / streptomicina.
- Una volta raggiunta la confluenza del 40%, trasporre le cellule con costrutti di scelta utilizzando un reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore. Mantenere le cellule trasfettate in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 per 15-18 h.
- Per ridurre le variazioni di pH e osmolarità (a causa dell'evaporazione) durante l'acquisizione di immagini, riempire le camere di coltura cellulare (prima dell'immagine) fino al 90% con un terreno pre-riscaldato a 37 ° C contenente 20 mM 4- (2-idrossietil) -1 -piperazinattanesolfonico (HEPES). SigillareIl coperchio, applicare un sottile strato di grasso di vuoto all'interno del coperchio e premere delicatamente sulla camera di coltura contenente le cellule trasfettate.
2. Acquisizione di immagini
NOTA: La lunghezza della filopodia varia da 2-10 μm 13 . La filopodia cresce ad una velocità media di 0,05-0,1 μm / s 13 , 14 .
- Acquisire le immagini usando un microscopio con obiettivo 60X o 100X e nessun pixel di binning (qui, un microscopio confocale a filatura disco). Utilizzare le frequenze di acquisizione superiori a 1 Hertz (Hz) per tenere traccia della dinamica filopodiale. Per ridurre al minimo gli artefatti fuori fuoco, filopodia dell'immagine vicina alla membrana basale (ad es. Superficie del substrato).
- Per garantire un monitoraggio regolare, regolare il tempo di esposizione della fotocamera e l'intensità laser in modo tale che il rapporto segnale / rumore (SNR) sia maggiore di 4. Evitare la saturazione dei singoli canali ( cioè i valori dei pixel255 per le immagini a 8 bit e 65,535 per le immagini a 16 bit), in quanto ciò precluderà l'analisi dell'immagine successiva.
- Per evitare il sanguinamento, utilizzare solo tag di fluorescenza compatibili con linee laser e filtri del microscopio (per ulteriori dettagli vedere il riferimento 15 ).
3. Pre-elaborazione di immagini
NOTA: Utilizzare ImageJ o un altro software disponibile per pre-elaborare le immagini 16 , 17 .
- Se il campione sta muovendo, correggere la deriva laterale usando il software disponibile ( ad es. Https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) prima dell'analisi. Escludi i film con deriva assiale (cioè movimento in direzione z).
- Sfondo corretto ( cioè valori grigi di aree al di fuori della cella), sbiancamento (perdita continua se l'intensità di fluorescenza dovuta a danni alle proteine di fluorescenza) e eventuale sanguinamento (segnale da un influenzaSonda di orescenza nei due canali) utilizzando il software disponibile ( ad esempio http://imagej.net/Category:Plugins e 16 , 17 ).
Nota: l'intensità di fluorescenza dei singoli canali non viene modificata dal software. - Per garantire un'analisi successiva delle immagini, salvare i filmati corrispondenti a particolari canali proteici in scala grigia come file formato impilato ".tiff" nella cartella di lavoro.
NOTA: Le dimensioni (dimensione e lunghezza) delle stack devono essere uguali per tutti i canali.
4. Analisi delle immagini - Fase 1: caricare le immagini
NOTA: Il software qui descritto è stato scritto in Matlab (indicato come software di programmazione) e verrà eseguito solo con questo programma.
- Scaricare la cartella con zip contenente tutti i file necessari per l'analisi delle immagini dal sito seguente: https://campus.uni-muenster.de/it/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwsiamo/. Deselezionare e copiare i file nella cartella di lavoro.
- Una volta installata, aprire il software di programmazione e eseguire 'filopodiaAnalysisM3.fig'. La finestra # 1 della GUI si apre come mostrato nella Figura 2A .
- Caricare i file ".tiff" impilati memorizzati in corrispondenza di una particolare proteina di interesse nella finestra GUI # 1 utilizzando i pulsanti <1b> per la proteina A, <1c> per la proteina B, <1d> per la proteina C. Vedere la Figura 2 e la Tabella 1 per i dettagli.
NOTA: La proteina A mostrata nella finestra GUI # 1 funge da canale di riferimento per l'analisi ratiometrica finale. - Crea un'immagine sovrapposta della cella dai canali proteici facendo clic su <1a>.
- Fare clic su <2a> per assegnare il primo fotogramma e <2b> per l'ultimo fotogramma utilizzato per l'analisi.
- Facoltativamente, ritagliare la regione di interesse (ROI) contenente il filopodium di interesse utilizzando il pulsante <2h>, ruotare l'immagine uPremere il tasto <2i> o eliminare le regioni indesiderate usando lo strumento di disegno a mano libera <2j>.
NOTA: Per semplificare l'analisi delle immagini, è consigliabile isolare il ROI ( vale a dire tagliare, ruotare, eliminare) insieme agli altri passaggi di pre-elaborazione (sottrazione di sfondo, correzioni della candeggina, ecc.) Utilizzando ImageJ. - Spostare il cursore <2c> per ogni telaio per il controllo della qualità e verificare se il filopodium rimane chiaramente visibile in tutto il filmato.
5. Analisi delle immagini - Fase 2: generazione di traccia
- Fare clic sul pulsante <3a> nella finestra GUI # 1 per aprire la finestra GUI # 2 (vedere la Figura 2B ).
- Fare clic sul pulsante <4> nella finestra GUI # 2 per generare la maschera del corpo cellulare sovrapposto (generato nella finestra GUI # 1 dopo aver fatto clic su <1a>). Il programma genera anche il limite della maschera, in cui è attuato lo scafo convesso per ottenere i punti di vertice.
- CliTasto ck <5>; Apparirà un cursore. Utilizzare il cursore per selezionare la base (da dove viene misurata la distanza della punta filopodiale) seguita dalla punta della filopodia nel fotogramma in cui viene prima visualizzata. A tale scopo, spostare il dispositivo di scorrimento in Finestra # 2).
NOTA: Per ridurre al minimo gli errori nell'uscita dati, posizionare il punto di base verticalmente sotto la punta filopodiale lungo l'asse. Posizionare il punto di base in altri luoghi ( ad es. Spostato lateralmente) può introdurre una polarizzazione direzionale nei valori di fluorescenza all'interno del corpo cellulare. - Selezionare la lunghezza della soglia (sopra la quale la filopodia si piegherà) usando <6c>.
Nota: Questa lunghezza è definita come la distanza tra il punto base (selezionato con <5>) e il limite del corpo cellulare ( cioè la regione da dove inizia la filopodia). La distanza misurata è in pixel. - Specificare il numero di segmenti utilizzati per approssimare la forma della filopodia nella casella <6a>.
NOTA: il mIl numero di segmenti inimum dipende dalla lunghezza massima raggiunta dal filopodium, ma anche dal modo in cui il filopodium si curva. Non selezionare un numero di segmenti più grandi del numero di pixel tra la base e la punta ( cioè la lunghezza della soglia). Selezione di più segmenti rispetto alla lunghezza della soglia definita al punto 5.4. ( Cioè il numero di pixel tra base e punta) comporterà una sovrastima della lunghezza del filopodium. - Specificare la larghezza di scansione, che funge da scanner orizzontale per inserire i nodi, in <6b>.
NOTA: Questi nodi vengono utilizzati dal programma per adattarsi alla linea che unisce la base e la punta con il corpo del filopodium ( cioè per creare la spina dorsale). Come punto di partenza, metti un valore in pixel pari alla lunghezza massima moltiplicata per un fattore di
. - Specificare il raggio di scansione (in pixel) nella casella <6d>. Utilizzare un valore che è circa il 50% più grande dell'obHa servito lo spostamento della punta inter-frame.
NOTA: Utilizzando un raggio di scansione molto grande potrebbe prendere punti indesiderati a scomparti convessi in strutture in cui non è presente alcuna punta filopodiale reale ( ad es. Fuori movimento piano o bassa SNR). - Specificare l'angolo di piegatura nella casella <6e>.
NOTA: La soglia angolare è determinata dall'angolo massimo del filopodium che si piega durante l'intera analisi. La specificazione della soglia di angolo aiuta il software ad escludere il monitoraggio delle strutture indesiderate che crescono dal lato della filopodia quando la filopodia si piega verso il corpo cellulare. Il programma funziona in modo affidabile per filopodia con angoli di inclinazione inferiori a 45 gradi rispetto all'asse verticale. - Per avviare il tracciamento, fare clic sul pulsante <Track & Analyze> nella finestra GUI # 2. Fai clic sulla casella "Storia traccia" nella finestra di interfaccia GUI # 2 per salvare l'intero protocollo di monitoraggio per futuri riferimenti.
NOTA: Dopo che la procedura di monitoraggio è completa, la lunghezza del filopodium in ogni fotogramma viene memorizzataIl foglio denominato 'length_vel' di 'dynamics.xlsx' per riferimenti futuri. Allo stesso modo, tutti gli altri parametri di tracciamento vengono memorizzati nel foglio denominato "parametri" di "dynamics.xlsx". - Facoltativamente, se la filopodia non viene rilevata automaticamente in tutti i fotogrammi, correggere manualmente le seguenti operazioni.
- Visitare il rispettivo fotogramma utilizzando il cursore nella finestra # 2 e selezionare manualmente la punta del filopodium.
Nota: i fotogrammi, in cui non vengono rilevati punti di scafo convessi, saranno rappresentati da una regione blu nella finestra di monitoraggio della finestra di interfaccia GUI # 2. È obbligatorio controllare il pulsante "Storia traccia" prima di avviare il programma di monitoraggio per accedere alle coordinate nodali in quel fotogramma. - Selezionare i punti di riferimento (base seguito dalla punta) usando <6f> nella finestra GUI # 2. Specificare gli altri parametri come "lunghezza della scansione", "misurazione accurata dopo" e "angolo di flessione massimo"; Per quella cornice come descritto nei passaggi 5.4-5.8.
- Fai clic sul pulsante <6i> per salvare i nuovi parametri (specifici di quel fotogramma). I passi devono essere ripetuti per tutti i frame indicati dalla regione blu.
- Al termine, reinizializzare la procedura di tracciamento utilizzando <7>.
NOTA: Questa correzione può essere utilizzata anche se il programma passa improvvisamente da un filopodiale ad un altro all'interno di un filmato. In alternativa, prendi in considerazione i filmati che contengono più filopodi.
- Visitare il rispettivo fotogramma utilizzando il cursore nella finestra # 2 e selezionare manualmente la punta del filopodium.
. 6. Analisi delle immagini - Passo 3: Analisi della proteina spaziale-temporale
- Per l'analisi spazio-temporale, selezionare la casella rappresentata da <8b> seguita dal canale proteico di interesse (<8c> e / o <8d> e / o <8e>).
Nota: è obbligatorio selezionare la proteina A prima dell'analisi ratiometrica (<9a>, <9b> e / o <9c>) poiché la proteina A viene utilizzata come riferimento. - Fai clic su <8a>Per avviare il tracciamento delle proteine lungo la lunghezza filopodiale utilizzando la traccia generata nel passaggio 5.9.
7. Analisi delle immagini - Fase 4: Analisi proteica rapporto-metrica
- Seleziona la casella di controllo <9b> o <9c> e fai clic sul pulsante <9a> per ottenere la trama ratiometrica spazio-temporale.
NOTA: Per evitare la falsa rappresentazione della concentrazione di proteine relativa, l'immagine ratiometrica non viene tracciata come X / Y ma come log (X / Y). Per uso futuro, la traccia ratiometrica viene esportata in file di formato '.png' e '.fig' e i dati della trama crudi vengono memorizzati nel file 'dynamics.xlsx'.
8. Analisi delle immagini - Passo 5: Analisi filopodiale delle punte
- Selezionare la casella <8f> e specificare la lunghezza e la lunghezza della punta dalla base usando <8g> e <8h>. Fare clic su <pulsante> per salvare i dati nel file 'dynamics.xlsx'. Clicca su <Analizza le intensità proteiche> per generareTraccia delle intensità proteiche della punta filopodiale e per salvare l'analisi ratiometrica.
NOTA: La lunghezza del puntale determina il numero di pixel della punta utilizzata per l'analisi. Il software restituirà il valore di intensità media dei pixel alla punta su ogni fotogramma. La lunghezza della soglia determina la distanza minima dalla base alla punta sopra la quale il filopodium (punta filopodiale) inizia a crescere (e quando il programma inizia a seguire il valore di intensità della punta). Quindi la lunghezza della punta deve essere inferiore alla lunghezza della soglia. - Fai clic sul rapporto desiderato da analizzare usando <9d> o <9e>.
- Fare clic sul pulsante di confronto <9a> per generare i dati ratiometrici.
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Representative Results
Utilizzando le cellule COS trasfettate con un marker per l'actina filamentosa (f-tractina 18 , rossa) e un riferimento citosolico (verde), abbiamo trovato protrusioni filopodiali ricche di actina ( figura 3A , pannello superiore). La serie temporale ha dimostrato che la filopodia si estende e si ritrae rapidamente ( figura 3A , pannello centrale). Utilizzando il software di analisi delle immagini, abbiamo quindi tracciato singole filopodie. Il confronto della lunghezza filopodiale misurata a mano rispetto al software di analisi delle immagini ha mostrato un valore di cross-correlazione di Pearson di 0.947 sostenendo che il software ha monitorato in modo affidabile l'estensione filopodiale 12 . Oltre ai tassi di crescita e di ritrazione di una singola filopodia, i kymographs in fondo alla Figura 3A descrivono anche le intensità di fluorescenza dell'attina (top), il riferimento citosolico (medio) e la relativa concentrazione di actina normalizzata al citoso(In basso). Insieme, questi esperimenti dimostrano che il programma misura in modo affidabile le dinamiche di crescita e la concentrazione di proteine relative allo spazio in tutto il ciclo di vita di un singolo filopodium nelle cellule COS.
Successivamente, abbiamo studiato la dinamica delle filopodie nei neuroni ippocampali coltivati nel mouse ( figura 3B , pannello superiore). Per questo, i neuroni sono stati trasfettati al giorno in vitro (DIV) 8 con f-tractina (rosso) e un riferimento citosolico (verde) ( figura 3B , pannello centrale). Come nell'esperimento precedente, i cymografi che mostrano intensità di fluorescenza dell'attina e del riferimento citosolico hanno mostrato che l'arricchimento relativo dell'attina precedette la formazione di filopodie esplorative dendritiche ( figura 3B , pannello inferiore). Questi risultati sono in linea con il lavoro pubblicato, descrivendo la formazione di patch ricchi di actina prima del filopodialeAllungamento 3 , 19 , 20 .
Figura 3: Esempi di Filopodia analizzati dal Software. ( A ) Panoramica immagine (pannello superiore) e serie temporali (centrale) delle cellule COS trasfettate con f-tractina (rosso) e marcatore citosolico (verde). Qui di seguito sono riportate diagrammi che illustrano l'analisi delle dinamiche di crescita filopodiali e la relativa concentrazione di f-tractina lungo il filopodium (pannelli inferiori). ( B ) Panoramica immagine del neurone ippocampale trasfettato con marcatore citosolico (top) e serie temporali di neurone trasfettato con f-tractina (rosso) e marcatore citosolico (verde) (pannello centrale), nonché diagramma che raffigura l'analisi della dinamica di crescita filopodiale dendritica E la concentrazione relativa di f-tractina lungo la sporgenza (pannelli inferiori).( C ) immagine SEM (pannello sinistro) e serie temporali di cellule HeLa trasfettate con f-tractina (pannello a destra). Notare le fluttuazioni dell'intensità di fluorescenza dovuta all'insufficienza filopodiale. Barre di scala = 20 μm (A, superiore), 50 μm (B, superiore), 10 μm (C, superiore). Questa cifra è stata modificata dal riferimento 12 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Infine, abbiamo cercato di sfidare il software monitorando la filopodia nelle celle HeLa. La filopodia nelle cellule HeLa è lunga ( figura 3C , pannello sinistro) e altamente dinamica, spesso lasciando il piano di acquisizione. Intrigante, quando si concentra sulla membrana basale, abbiamo osservato una sub-frazione di filopodia per subire una torsione elicoidale ( figura 3C , pannello superiore destro), in cui parti del filopodium transAbbandonò il piano focale. Di conseguenza, i cymografi che rappresentavano l'intensità assoluta della fluorescenza della tractina f hanno mostrato variazioni d'onda dell'intensità di fluorescenza nel tempo ( Figura 3C , pannello a destra destro). Questo comportamento ricorda l'instabilità filopodiale, un meccanismo recentemente descritto per essere utilizzato da filopodia per esercitare forze di tiro 5 .
In sintesi, questi esperimenti dimostrano che il software è in grado di seguire in modo affidabile le concentrazioni di proteine e le dinamiche di crescita dei filopodiali provenienti da varie origini.
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Discussion
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per il monitoraggio delle dinamiche di crescita filopodale e l'analisi di concentrazioni di proteine relative in queste strutture dinamiche attraverso l'algoritmo convesso. Utilizzando il software, fino a 3 canali possono essere confrontati in coppia in una singola esecuzione, per cui le relative concentrazioni di due canali ( cioè le proteine) vengono determinate durante il ciclo di estensione / ritrazione e memorizzate come file immagine e dati in cartelle separate. Oltre alle operazioni di routine, il software fornisce anche una serie di parametri che possono essere modificati per ottimizzare l'analisi per il rispettivo esperimento. Una descrizione dettagliata di queste modifiche e la risoluzione dei problemi possono essere trovate nella sezione del protocollo e nella tabella 1 .
L'analisi delle immagini non è limitata a un particolare tipo di microscopio, ma alla qualità dell'immagine della serie temporale. Considerando la sua pertinenza, la qualità dell'immagine dovrebbe essere ottimizzata per eCanale durante l'acquisizione. I nostri esperimenti mostrano che l'algoritmo funziona meglio per filopodia con SNR> 4 acquisite a 1 Hz utilizzando un obiettivo con ingrandimento superiore a 40X e nessun pixel di binning. Naturalmente, questo vale solo finché i fluorofori sono compatibili con le impostazioni del filtro ( vale a dire senza sfiato, vedere la sezione 2 del protocollo per dettagli). Considerando che le intensità relative sono confrontate l'una contro l'altra, l'analisi non è sensibile a piccole differenze nelle intensità del segnale assolute di fluorescenza tra le singole cellule. Pertanto, per dedurre dati significativi, un canale di riferimento ben definito ( p.es. marcatore citosolico) è di grande importanza. Tuttavia, anche se la qualità dell'immagine è buona, ci sono alcune limitazioni biologiche. Per esempio, non è adatto ad analizzare strutture che si ramificano, inclinano più di 45 gradi dall'asse ortogonale alla superficie cellulare o in cui altri oggetti stanno attraversando la struttura che viene studiata.
<P class = "jove_content"> Oltre a queste limitazioni sperimentali, ci sono punti critici all'interno del protocollo che devono essere considerati quando si utilizza il software, in quanto ciò potrebbe in altri casi causare messaggi di errore. In primo luogo, i canali corrispondenti ad una particolare proteina devono avere una stessa dimensione e rappresentano esattamente lo stesso ROI. In secondo luogo, i file impilati devono essere in formato '.tiff' in formato grigio. In terzo luogo, i file di immagini impilati devono trovarsi nella cartella di lavoro. E infine, i nomi dei file di dati nella cartella di lavoro non devono essere modificati, a meno che non sia corretto nel codice.Come si confronta lo script con altri metodi esistenti? Per sondare il nostro software di analisi delle immagini, abbiamo scaricato una serie di soluzioni software recentemente pubblicate che analizzano le funzionalità filopodiali 6 , 10 , 21 , 22 , 23 , , 25 e ha testato tutti per un certo numero di criteri selezionati. Un confronto dettagliato è riportato nella tabella 2 .
| Tsygankov et al. | Barry et al. | Nilufar et al. | Fanti et al. | Constantino et al. | Hendri- Cusdottir et al. | Tarnok et al. | Saha et al. | |
| Documento DOI | 10,1083 / jcb.201306067 | 10,1083 / jcb.201501081 | 10,1186 / 1752-0509-7-66 | 10.1002 / dneu.20866 | 10.1016 / j.jneumeth. 2008.02.009 | 10.1016/j.jneumeth. 2014.08.016 | 10.1002 / cyto.a.22569 | 10,1091 / mbc. E16-06-0406 |
| Software (download link) | http: //www.hahnlab. com / tools / IL softwarepage. html | http: // JCB-DataViewer. rupress.org/jcb/ sfogliare / 9059 / | http: //www.perkinslab .ca / pub / NMLP20XX. html | http: //www.ifc. unam.mx/ FFM / download.html | http: // fournierlab. mcgill.ca/ stile-7 / fTracker.html | https: // fdynamics. wordpress.com/ | http: // cnblab. elte.hu/dfma | https://campus.uni-muenster.de/index.php?id=13794&L=1 |
| Tipo di programma | Matlab | ImageJ | Matlab | ImageJ | Matlab | Matlab | ImageJ | Matlab |
| operazione | automatizzato | automatizzato | automatizzato | semiautomatico | semiautomatico | semiautomatico | semiautomatico | semiautomatico |
| Analisi singola / batch | entrambi | entrambi | singolo | singolo | singolo | singolo | singolo | singolo |
| Analisi intere cellule vs subregione | totale | totale | entrambi | entrambi | entrambi | sub | sub | sub |
| Multiplo / filopodia individuale | multiplo | multiplo | multiplo | multiplo | multiplo | ind | ind | ind |
| L'identificazione filopodiale e l'ispezione visiva possibile | sì | sì | no | sì | sì | sì | sì | |
| Elaborazione delle immagini possibile | no | no | no | sì | no | no | no | sì |
| Lunghezza filopodiale | sì | sì | sì | sì | sì | sì | sì | sì |
| Dinamiche di crescita filopodiale | sì | sì | no | sì | sì | sì | sì | sì |
| Vita filopodiale | sì | sì | no | sì | sì | sì | sì | sì |
| Analisi ratiometrica in filopodia | no | no | no | no | no | no | no | Sì </ Td> |
| Uscita / formato di archiviazione | Immagini / file di dati | Immagini / file di dati | Immagini / file di dati | Immagini / file di dati | Immagini / file di dati | Immagini / file di dati | Immagini / file di dati | Immagini / file di dati |
Tabella 2: Panoramica delle soluzioni di analisi delle immagini assistite software per la quantificazione di Filopodia.
Dalle otto soluzioni software di analisi sperimentale, cinque sono state gestite tramite Matlab, mentre le altre tre utilizzate ImageJ. Due soluzioni software ( tabella 2 a sinistra) sono state completamente automatizzate e ottimizzate per l'analisi in batch della durata, della durata e della dinamica di filopodia in celle intere. Delle sei soluzioni software rimanenti, cinque richiedevano ulteriori input manuali ( cioè semiautomatici), mentre uno era completamente automatizzato. Tuttavia, solo thLe soluzioni semi-automatizzate forniscono informazioni dettagliate sulle dinamiche di crescita di filopodia, sul tempo di vita e sull'identità. Tra questi cinque rimanenti, tre sono stati ottimizzati per l'analisi subcellulare della singola filopodia, mentre due potrebbero elaborare più filopodi in parallelo. Importante, da tutte le otto soluzioni software testate, solo un approccio consentiva di combinare informazioni sulle dinamiche di crescita filopodiale con la localizzazione proteica della proteina all'interno di queste strutture a dito ( tabella 2 , a destra).
Sebbene il nostro software di analisi delle immagini non sia adatto per analisi automatiche di batch o intero cellulare, la quantificazione di una filopodia isolata richiede solo pochi minuti. Quindi, immaginiamo che la quantificazione delle dinamiche proteiche in 40-50 filopodi sia fattibile in un solo giorno con il software attuale. Al contrario, le schermate ad alto rendimento possono richiedere ulteriori modifiche al codice per semplificare l'immissione e l'immagazzinamento di migliaia di singoli filopodi in un sistema automatizzatomaniera. Sulla base dei parametri necessari, altre soluzioni software esistenti possono quindi essere più adatte ad un tale approccio. Tenendo presente queste limitazioni, il software fornisce una piattaforma affidabile per indagare la concentrazione proteica spazi-temporale in strutture protrusive come le cellule. Considerando che le filopodie non sono le uniche strutture cellulari, è plausibile immaginare che il software di analisi delle immagini presentato possa anche essere adatto a studiare la dinamica delle proteine in altri processi biologici ( ad es. Neuriti, cilia primaria).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono i finanziamenti del DFG (EXC-1003 a MG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovine serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stock solution) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cells | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscope | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
References
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