흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징
Summary
이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다.
Abstract
혈소판은 혈관 침범을 봉쇄하기위한 혈전 형성의 지혈에 필수적인 요소입니다. 또한 혈전증, 혈관을 막아 장기를 손상시키는 혈전 형성에 생명을 위협하는 결과를 초래합니다. 이것은 혈소판 기능에 대한 과학적 연구와 흐름 조건에서 일어날 때 세포 생물학적 과정을 추적하는 방법 개발의 동기를 부여합니다.
혈소판 접착 및 응집의 연구를 위해 다양한 유동 모델을 사용할 수 있는데, 혈소판 생물학의 두 가지 주요 현상입니다. 이 연구는 활성화 동안 혈류에서 실시간으로 혈소판 탈과립을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 와이드 필드 역전 된 LED 기반 형광 현미경 아래에 놓인 주사기 펌프 셋업에 연결된 유동 챔버를 사용합니다. 여기에 설명 된 설정은 형광으로 표지 된 항체 또는 형광으로 전달되는 다중 형광 물질의 동시 여기를 허용합니다염료. 라이브 셀 이미징 실험 후 커버 유리는 정적 현미경 ( 즉, 공 초점 현미경 또는 주사 전자 현미경)을 사용하여 추가 처리 및 분석 될 수 있습니다.
Introduction
혈소판은 혈류를 순환하는 무핵 세포입니다. 그들의 주요 기능은 손상 부위에서 혈관 침범을 봉쇄하고 출혈을 막는 것입니다. 이러한 부상 부위에서, 내피 내 콜라겐 섬유가 노출되고이어서 다량 단백질, 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)로 덮힌 다. VWF는 세포 표면의 당 단백질 Ibα-IX-V 복합체에 의존하는 메커니즘으로 혈소판과 순환 적으로 상호 작용하여 혈소판의 속도를 늦춘다. 이것은 고 전단 속도에서 특히 중요합니다. 이어서 혈소판은 콜라겐으로부터 활성화 자극을받는 동안 형태 학적 변화를 겪습니다. 이것은 돌이킬 수없는 퍼짐 및 결국 혈소판 응집을 유도한다. 두 공정 모두 혈소판 – 혈소판 혼입을 촉진하기 위해 과립 내용물의 분비에 달려있다. 그 중에서도 혈소판 알파 과립에는 혈소판의 부착과 다리를 돕기 위해 섬유소원과 VWF가 포함되어 있습니다혈소판을 인테그린에 의존적으로 결합시킨다. 혈소판 고밀도 과립에는 혈소판 활성화를 강화시키는 데 도움이되는 칼슘 및 아데노신 디 포스페이트 (ADP)를 비롯한 무기 화합물 2가 포함되어 있습니다. 또한 혈소판에는 (알레르기) 염증 3 매개체, 보체 – 조절 단백질 4 및 혈관 신생 인자 5,6 이 포함되어있어 이러한 내용물이 다양한 조건에서 어떻게 다르게 방출되는지 여부와 문제에 대한 의문을 제기합니다.
1980 년대 이래로, 혈류 모델에서 혈소판 기능에 대한 연구는 혈전 메커니즘의 연구에 유용했다. 그 이후로 많은 기술적 진보가 이루어졌으며, 피브린 형성을 포함하는 유동 모델은 현재 생체 내 에서 치료 용 혈소판 농축 물의 지혈 가능성을 평가하기 위해 개발되었다.혈전 형태학에 전단 율의 교란이 미치는 영향을 조사 9 . 병리학 적 혈전 형성 (혈전증)에 비해 안정적인 접착 및 생리적 인 혈전 형성 (지혈)을 유도하는 분자 및 세포 – 생물학적 기전의 차이는 매우 미묘 할 수 있으며, 이러한 세포 내 (subcellular)의 실시간 시각화를 허용하는 흐름 모델의 개발을 동기 부여 할 수있다 프로세스.
그러한 셋업이 가치있는 과정의 예는 세포 내 폴리 인산염의 (재) 분포와 응고 인자의 동원에 의해 섬유소 미세 구조에 미치는 영향을 밝혀줍니다. 연구는 종종 종단점 분석으로 제한됩니다. 기술 된 방법의 주 목적은 혈류가 활성화 된 상태에서 혈소판 활성화 과정에서 발생하는 동적 세포 과정을 실시간으로 시각적으로 조사 할 수있게하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전 세계적으로 혈전증은 사망 및 이환율의 주요 원인이며 혈소판은 그 발달에 중심적인 역할을합니다. 이 작품은 흐름 아래 혈소판 degranulation의 라이브 셀 이미징을위한 방법을 설명합니다. 일반적으로 혈소판이 활성화되면 모든 세분화 된 내용물이 직접 용액으로 방출된다고 가정합니다. 수반되는 결과는 이것이 꼭 그런 것은 아니라는 것을 암시한다. 접착 및 탈과립시 혈소판은 상당량의 폴리…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CM은 C1- 저해제 결핍증 (HAEi), Vladen van Het UMC Utrecht 및 수혈 연구를위한 Landsteiner 재단 (LSBR)에 대한 국제 환자기구의 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |
References
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
