प्लेटलेट डीग्रेन्युलेशन और स्राव के तहत लाइव-सेल इमेजिंग फ्लो
Summary
यह काम प्लेटलेट आसंजन, फैल और स्राव के प्रवाह के अध्ययन के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी-आधारित पद्धति का वर्णन करता है। यह बहुमुखी मंच घनास्त्रता और हेमोस्टेसिस पर तंत्रिकी अनुसंधान के लिए प्लेटलेट समारोह की जांच को सक्षम करता है।
Abstract
रक्त प्लेटलेट हेमोस्टेसिस में आवश्यक खिलाड़ी हैं, रक्त वाहिका को तोड़ने के लिए thrombi का गठन। वे घनास्त्रता में भी शामिल हैं, थ्रॉम्बी का गठन होता है जो प्राणघातक और अंगों को घायल करते हैं, जीवन-धमकी के परिणाम के साथ। यह प्लेटलेट फ़ंक्शन पर वैज्ञानिक अनुसंधान और कोशिका-जैविक प्रक्रियाओं को ट्रैक करने के तरीकों के विकास को प्रेरित करता है क्योंकि वे प्रवाह की स्थिति के तहत होते हैं।
प्लेटलेट आइडियेशन और एकत्रीकरण के अध्ययन के लिए प्लेटलेट जीव विज्ञान में दो प्रमुख घटनाएं उपलब्ध हैं। यह कार्य सक्रियण के दौरान प्रवाह के अंतर्गत रीयल-टाइम प्लेटलेट डीग्रेन्युलेशन का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। विधि एक सिरिंज-पंप सेटअप के साथ मिलकर एक प्रवाह कक्ष का उपयोग करता है जो एक व्यापक-क्षेत्र, उल्टे, एलईडी-आधारित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के नीचे रखा जाता है। यहाँ वर्णित सेटअप फ्लोरोसेंट लेबलिंग एंटीबॉडी या फ्लोरोस के द्वारा वितरित कई फ्लोरोफोर्स के साथ-साथ उत्तेजना के लिए अनुमति देता हैएंट रंजक लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोगों के बाद, कवर ग्लास को और आगे प्रोसेस किया जा सकता है और स्टैटिक माइक्रोस्कोपी ( यानी, कन्फोकल माइक्रोस्कोपी या स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है।
Introduction
प्लेटलेट रक्त कोशिकाओं में प्रसारित होते हैं जो रक्त प्रवाह में प्रसारित होते हैं। उनका मुख्य कार्य चोट की साइटों पर संवहनी उल्लंघनों को सील करना और रक्त के नुकसान को रोकने के लिए है। चोट की इन साइटों पर, उप-थिंटेल्हेियल कोलेजन फाइबर उजागर हो जाते हैं और बाद में मल्टीमीरिक प्रोटीन, वॉन विलेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ) द्वारा कवर किया जाता है। वीडब्ल्यूएफ़ प्लेटलेट्स की गति को धीमा करते हुए सेल की सतह 1 पर ग्लाइकोप्रोटीन आईबीएनए-इले-वी कॉम्प्लेक्स पर निर्भर तंत्र में परिसंचरण के साथ संपर्क करता है। उच्च कतरनी दर पर यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। कोलेजन से क्रियाशील आवेगों को प्राप्त करते समय बाद में प्लेटलेट्स में रूपात्मक परिवर्तन होते हैं। इससे अपरिवर्तनीय फैल जाता है और आखिरकार प्लेटलेट एकत्रीकरण हो जाता है। प्लेटलेट-प्लेटलेट क्रोसस्टल की सुविधा के लिए दोनों प्रक्रियाएं ग्रेन्युल सामग्री के स्राव पर निर्भर करती हैं। दूसरों के बीच, प्लेटलेट α-granules में फाइब्रिनोजेन और VWF होते हैं जो प्लेटलेट आसंजन की सहायता करते हैं और पुलप्लेटलेट एक साथ एक एकीकृत-आधारित तरीके से प्लेटलेट-घने ग्रैन्यूल में कैल्शियम और एडेनोसिन डीफोफॉसेट (एडीपी) समेत अकार्बनिक यौगिक 2 होते हैं, जो प्लेटलेट सक्रियण को मजबूत करने में मदद करते हैं। इसके अलावा, प्लेटलेट में (एलर्जी) सूजन 3 , पूरक-नियंत्रण प्रोटीन 4 , और एंजियोजेनेस कारक 5 , 6 के मध्यस्थ होते हैं, ये प्रश्न उठाते हैं कि इन सामग्रियों को अलग-अलग परिस्थितियों में किस प्रकार अलग-अलग जारी किया जाता है।
1 9 80 के दशक से, प्रवाह मॉडल में प्लेटलेट फ़ंक्शन का अध्ययन थ्रोम्बोटिक तंत्रों की जांच के लिए मूल्यवान रहा है। तब से, बहुत तकनीकी प्रगति की गई है, और प्रवाह मॉडल जिनमें आतंच गठन शामिल है, वर्तमान में चिकित्सीय प्लेटलेट की हेमोस्टैटिक क्षमता परख लगाने के लिए विकसित किया गया है, पूर्व विवो 8 याथ्रोम्बस आकारिकी 9 पर कतरनी दर में गड़बड़ी के प्रभाव की जांच आणविक और सेल-जैविक तंत्रों में अंतर जो स्थिर आसंजन और शारीरिक थ्रोम्बस गठन (हेमोस्टैसिस) बनाम रोगी थ्रोम्बस गठन (घनास्त्रता) को लेकर बहुत अंतर हो सकता है और प्रवाह मॉडल के विकास को प्रेरित कर सकता है जो इन सबसुलुलर के वास्तविक-समय दृश्य के लिए अनुमति देते हैं। प्रक्रियाओं।
ऐसी प्रक्रिया का एक उदाहरण जिसके लिए ऐसी स्थापना बहुमूल्य होगी, अंतराल परमाणु पॉलीफोस्फेट (पुनः) वितरण और थक्केदार कारकों की भर्ती, समय-आश्रित प्रभाव को उजागर करने के लिए है, जो कि फाइब्रिन मूलभूत संरचना 10 पर है । अध्ययन अक्सर अंत-बिंदु के विश्लेषण तक ही सीमित होते हैं। वर्णित विधि का मुख्य उद्देश्य प्रवाह के तहत प्लेटलेट सक्रियण के दौरान होने वाली गतिशील उपसर्भक प्रक्रियाओं की रीयल-टाइम विज़ुअल जांच को सक्षम करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
दुनियाभर में, घनास्त्रता मौत और रोग का एक प्रमुख कारण है, और प्लेटलेट्स इसके विकास में एक केंद्रीय भूमिका निभाती हैं। यह काम प्रवाह के तहत प्लेटलेट डीग्रेन्युलेशन के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक विधि का …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सीए-इन्हिबिटर कमियों (हैई), स्टिचिंग वीरिएडन वैन हेट यूएमसी यूट्रेक्ट, और लैंडस्टीयर फाउंडेशन फॉर ब्लड ट्रान्सफ्यूजन रिसर्च (एलएसबीआर) के लिए अंतर्राष्ट्रीय रोगी संगठन से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है।
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |
References
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