Imaging di cellule vive di degranulazione piastrinica e secrezione sotto flusso
Summary
Questo lavoro descrive un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per lo studio dell'adesione piastrinica, della diffusione e della secrezione sotto flusso. Questa piattaforma versatile permette di studiare la funzione piastrinica per la ricerca meccanicistica sulla trombosi e sull'emostasi.
Abstract
Le piastrine di sangue sono giocatori essenziali in emostasi, la formazione di trombi per sigillare violazioni vascolari. Sono anche coinvolti nella trombosi, nella formazione di trombi che occludono la vascolarizzazione e danno gli organi, con conseguenze pericolose per la vita. Questo motiva la ricerca scientifica sulla funzionalità piastrinica e lo sviluppo di metodi per tenere traccia dei processi biologici in fase di flusso.
Sono disponibili diversi modelli di flusso per lo studio dell'adesione e dell'aggregazione delle piastrine, due fenomeni chiave della biologia piastrinica. Questo lavoro descrive un metodo per studiare la degranulazione piastrinica in tempo reale in fase di attivazione. Il metodo utilizza una camera di flusso accoppiata ad una messa a punto della pompa a siringa posta sotto un microscopio a fluorescenza a LED basato su ampio campo, invertito. L'impostazione qui descritta consente l'eccitazione simultanea di fluorofori multipli che vengono fornite da anticorpi a fluorescenza o fluorescentiColoranti ent. Dopo gli esperimenti di immagini a cellule vive, i vetri di copertura possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando microscopia statica ( cioè microscopia confocale o microscopia a scansione elettronica).
Introduction
Le piastrine sono cellule anucleate che circolano nel flusso sanguigno. La loro funzione principale è quella di sigillare le ferite vascolari nei siti di lesioni e di prevenire la perdita di sangue. In questi siti di lesioni, le fibre di collagene subendoteliale diventano esposte e successivamente sono coperte dalla proteina multimerica, il fattore von Willebrand (VWF). VWF interagisce con le piastrine in circolazione in un meccanismo che dipende dal complesso glicoprotein Ibα-IX-V sulla superficie cellulare 1 , rallentando la velocità delle piastrine. Ciò è particolarmente importante a velocità elevate. Le piastrine successivamente subiscono cambiamenti morfologici mentre ricevono impulsi di attivazione dal collagene. Ciò porta ad una diffusione irreversibile e alla fine alla aggregazione piastrinica. Entrambi i processi dipendono dalla secrezione del contenuto di granuli per facilitare la crosstalk piastrinica. Tra gli altri, le piastrine α-granuli contengono fibrinogeno e VWF per assistere l'adesione piastrinica e per ponteLe piastrine insieme in un modo integrin-dipendente. I granuli piastriniti contengono composti inorganici 2 , inclusi il calcio e l'adenosina difosfato (ADP), che contribuiscono a rafforzare l'attivazione delle piastrine. Inoltre, le piastrine contengono mediatori di infiammazione (allergica) 3 , proteine di controllo del complemento 4 e fattori di angiogenesi 5 , 6 , sollevando le questioni di se e come tali contenuti vengono diffusi differenzialmente in condizioni diverse.
Dagli anni Ottanta, lo studio della funzionalità piastrinica nei modelli di flusso è stato prezioso per la ricerca di meccanismi trombotici 7 . Da allora, sono stati fatti molti progressi tecnici e sono stati sviluppati modelli di flusso che includono la formazione di fibrina per analizzare il potenziale emostatico dei concentrati terapeutici piastrinici ex vivo 8 oIndagare l'influenza dei disturbi in velocità di taglio sulla morfologia del trombo 9 . Le differenze nei meccanismi molecolari e cellulari che conducono adesione stabile e formazione di trombi fisiologici (emostasi) rispetto alla formazione di trombi patologici (trombosi) possono essere molto sottili e motivare lo sviluppo di modelli di flusso che consentono la visualizzazione in tempo reale di queste subcellulari processi.
Un esempio di un processo per cui una tale configurazione sarebbe preziosa è la (ri) distribuzione del polifosfato intracellulare e l'assunzione di fattori di coagulazione per scoprire l'impatto dipendente dal tempo che questo ha sull'ultrastruttura della fibrina 10 . Gli studi sono spesso limitati alle analisi dei punti finali. Lo scopo principale del metodo descritto è quello di consentire l'esame visivo in tempo reale dei processi subcellulari dinamici che si verificano durante l'attivazione piastrinica sotto flusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
In tutto il mondo, la trombosi è una causa principale di morte e morbilità e le piastrine hanno un ruolo centrale nel suo sviluppo. Questo lavoro descrive un metodo per l'imaging a cellule vive della degranulazione piastrinica sotto il flusso. Generalmente si presume che, quando le piastrine si attivano, tutti i contenuti granulari vengono direttamente rilasciati in soluzione. I risultati di accompagnamento suggeriscono che questo non è necessariamente il caso. Durante l'aderenza e la degranulazione, le piast…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CM riconosce il sostegno finanziario dell'Organizzazione Internazionale del Paziente per le Deficienze C1-Inibitore (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht e la Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |
References
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