Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.
As plaquetas são jogadores essenciais na hemostasia, a formação de trombos para selar as violações vasculares. Eles também estão envolvidos em trombose, a formação de trombos que obstruem a vasculatura e ferem órgãos, com conseqüências que ameaçam a vida. Isso motiva a pesquisa científica sobre a função plaquetária e o desenvolvimento de métodos para rastrear processos biológicos celulares, pois ocorrem em condições de fluxo.
Uma variedade de modelos de fluxo estão disponíveis para o estudo da adesão e agregação de plaquetas, dois fenômenos-chave na biologia das plaquetas. Este trabalho descreve um método para estudar a degranulação de plaquetas em tempo real sob fluxo durante a ativação. O método faz uso de uma câmara de fluxo acoplada a uma configuração de bomba de seringa que é colocada sob um microscópio de fluorescência à base de LED de campo largo e invertido. A configuração descrita aqui permite a excitação simultânea de múltiplos fluoróforos que são administrados por anticorpos marcados com fluorescência ou fluorescentesCorantes. Após experiências de imagem de células vivas, os óculos de cobertura podem ser processados e analisados usando microscopia estática (por exemplo , microscopia confocal ou microscopia eletrônica de varredura).
As plaquetas são células anucleadas que circulam na corrente sanguínea. Sua principal função é selar as rupturas vasculares em locais de lesão e prevenir a perda de sangue. Nesses locais de lesão, as fibras subendoteliais de colágeno tornam-se expostas e são posteriormente cobertas pela proteína multimérica, o fator von Willebrand (VWF). O VWF interage com as plaquetas em circulação em um mecanismo que depende do complexo de glicoproteína Ibα-IX-V na superfície celular 1 , diminuindo a velocidade das plaquetas. Isto é particularmente importante a altas taxas de cisalhamento. As plaquetas subseqüentemente sofrem alterações morfológicas enquanto recebem impulsos ativadores do colágeno. Isso leva a disseminação irreversível e, eventualmente, a agregação de plaquetas. Ambos os processos dependem da secreção de conteúdos de grânulos para facilitar a interferência plaquetária-plaquetas. Entre outros, os grânulos α plaquetários contêm fibrinogênio e VWF para auxiliar a adesão plaquetária e a ponteAs plaquetas juntas de uma maneira dependente da integrina. Os grânulos densos de plaquetas contêm compostos inorgânicos 2 , incluindo o difosfato de adenosina e cálcio (ADP), que ajudam a reforçar a ativação plaquetar. Além disso, as plaquetas contêm mediadores da inflamação (alérgica) 3 , proteínas de controle do complemento 4 e fatores de angiogênese 5 , 6 , aumentando as questões de se e como esses conteúdos são diferencialmente liberados em condições variáveis.
Desde a década de 1980, o estudo da função plaquetária em modelos de fluxo tem sido valioso para a investigação de mecanismos trombóticos 7 . Desde então, muitos progressos técnicos foram feitos e os modelos de fluxo que incluem a formação de fibrina são atualmente desenvolvidos para testar o potencial hemostático de concentrados de plaquetas terapêuticas ex vivo 8 ou paraInvestigar a influência de distúrbios nas taxas de cisalhamento na morfologia do trombo 9 . As diferenças nos mecanismos moleculares e biológicos celulares que conduzem a adesão estável e formação de trombo fisiológico (hemostasia) versus formação de trombo patológico (trombose) podem ser muito sutis e motivar o desenvolvimento de modelos de fluxo que permitam a visualização em tempo real desses sub-celulares Processos.
Um exemplo de um processo para o qual essa configuração seria valiosa é a (re) distribuição de polifosfato intracelular e o recrutamento de fatores de coagulação para descobrir o impacto dependente do tempo que isso tem na ultraestrutura da fibrina 10 . Os estudos geralmente são limitados a análises de ponto final. O objetivo principal do método descrito é habilitar a pesquisa visual em tempo real de processos subcelulares dinâmicos que ocorrem durante a ativação plaquetária sob fluxo.
Em todo o mundo, a trombose é uma das principais causas de morte e morbidade, e as plaquetas desempenham um papel central no seu desenvolvimento. Este trabalho descreve um método para a imagem de células vivas de degranulação de plaquetas sob fluxo. Em geral, assume-se que, quando as plaquetas se ativam, todos os conteúdos granulares são liberados diretamente na solução. Os resultados que acompanham sugerem que este não é necessariamente o caso. Durante a adesão e degranulação, as plaquetas retêm uma quan…
The authors have nothing to disclose.
O CM reconhece o apoio financeiro da Organização Internacional de Pacientes para Deficiências de Inibidores de C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht e a Fundação Landsteiner para Pesquisa de Transfusão de Sangue (LSBR).
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
NaCl | Sigma | 31434 | |
KCl | Sigma | 31248 | |
MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
Tris | Roche | 10708976 | |
Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |