Detta protokoll beskriver en metod för att noggrant mäta den nukleocytoplasmatiska transporthastigheten inom motor neuronliknande NSC-34-celler genom att kvantifiera förändringen i realtid i nukleär import av ett NLS-NES-GFP-protein.
Nukleocytoplasmisk transport avser import och export av stora molekyler från cellkärnan. Nyligen har ett antal studier visat en samband mellan amyotrofisk lateralskleros (ALS) och nedsatt nukleocytoplasmisk vägen. ALS är en neurodegenerativ sjukdom som påverkar motorneuronerna och resulterar i förlamning och slutligen i död, inom 2-5 år i genomsnitt. De flesta fall av ALS är sporadiska, saknar någon uppenbar genetisk koppling, men 10% ärvt på ett dominerande sätt. Nyligen identifierades hexanukleotidrepetitionsutvidgningar (HRE) i kromosom 9 öppen läsram 72 (C9orf72) gen som en genetisk orsak till ALS och frontotemporal demens (FTD). Det är viktigt att olika grupper nyligen föreslog att dessa mutanter påverkar nukleocytoplasmisk transport. Dessa studier har mestadels visat det slutliga resultatet och manifestationer som orsakats av HRE på nukleocytoplasmisk transport, men de visar inte dysfunktion i kärntransporter irealtid. Som ett resultat kan endast allvarlig nukleocytoplasmisk transportbrist bestämmas, främst beroende på hög överuttryck eller exogen proteininsättning.
Detta protokoll beskriver en ny och mycket känslig analys för att utvärdera och kvantifiera nukleocytoplasmisk transportdysfunktion i realtid. Importen av ett NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP) kan kvantifieras i realtid med användning av fluorescerande mikroskopi. Detta utförs genom att använda en exportinhibitor, vilket möjliggör att shuttle GFP bara kommer in i kärnan. För att validera analysen användes de C9orf72 HRE-translaterade dipeptidreceptionerna, poly (GR) och poly (PR), vilka tidigare har visats störa nukleocytoplasmisk transport. Med hjälp av den beskrivna analysen observerades en 50% minskning av nukleär importhastighet jämfört med kontrollen. Genom att använda detta system kan minutförändringar i nukleocytoplasmisk transport undersökas och förmågan hos olika faktorer att rädda (även delvis) en nukleocytoplasmisk trAnsökningsfel kan bestämmas.
Kärnporekomplexet (NPC) kontrollerar import och export av stora molekyler in i och ut ur cellkärnan. I motsats till små molekyler, som kan komma in i kärnan utan reglering 1 , styrs transporten av större molekyler starkt av NPC. Dessa stora molekyler, såsom proteiner och RNA, associerar med transportfaktorer, inklusive importin och exportin, som ska importeras och exporteras från kärnan 2 . För att kunna importeras måste proteiner innehålla ett litet peptidmotiv, i allmänhet kallat en nukleär lokaliseringssignal (NLS), som är bunden av importins 2 . Dessa sekvenser av aminosyror verkar som en etikett och är olika i komposition 3 , 4 . Proteiner kan exporteras från kärnan till cytoplasma på grund av deras association med exportinS, som binder en signalsekvens, generellt kallad en kärntransportsignal (NES) 2 . Både importins och exportins kan transportera sin last på grund av reglering av den lilla Rasrelaterade kärnprotein-GTPasen (Ran) 2 . Ran har visats existera i olika konformationella tillstånd beroende på om den är bunden till GTP eller BNP. När den är bunden till GTP, kan Ran binda till import eller export. Vid bindning till RanGTP släpper importins sin last, medan exportinslutningar måste binda RanGTP för att bilda ett komplex med sin exportlast. Det dominerande nukleotidbindande tillståndet av Ran beror på dess placering i kärnan (RanGTP) eller cytoplasman (RanGDP).
Nyligen har ett antal studier visat en samband mellan försämringar i nukleocytoplasmisk vägen och både amyotrofisk lateralskleros (ALS) och frontotemporal demens (FTD) 5 , 6 </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS är en progressiv och dödlig neurodegenerativ sjukdom som påverkar både övre och nedre motorneuroner (MNs) 13 och resulterar i förlamning och slutligen i död, inom 2-5 år i genomsnitt. De flesta fall av ALS klassificeras som sporadiska (SALS), saknar någon uppenbar genetisk koppling, men 10% ärar på ett dominerande sätt (familjen ALS, FALS). Nyligen identifierades hexanukleotidrepetitionsexpansioner (HRE) i kromosom 9 öppen läsram 72 (C9orf72) gen 14,15 som en genetisk orsak till ALS och FTD. Dessa mutanter står för 30-40% av FALS-fallen 16 , och olika studier har ifrågasattAtt de orsakar toxicitet genom att påverka nukleocytoplasmisk transport 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Dessa studier har mestadels visat de slutliga resultaten och manifestationerna av HRE på nukleocytoplasmisk transport, men de visar inte nukleocytoplasmisk störning i realtid. Som ett resultat har endast svår nukleocytoplasmisk transportbrist utvärderats 11 , 17 , 18 .
Detta protokoll beskriver en ny och veRy-känslig analys för att utvärdera och kvantifiera nukleocytoplasmisk transportdysfunktion i realtid. Importen av ett NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP) kan kvantifieras i realtid med användning av fluorescerande mikroskopi. Detta görs med användning av en exportinhibitor, såsom beskrivits tidigare 18 , vilket medger att shuttle-GFP enbart kommer in i kärnan. Med hjälp av floriserande mikroskopi och en mjukvara som kan kvantifiera fluorescerande förändringar i realtid, är det möjligt att kvantifiera gradvisa förändringar i fluorescensintensiteten hos shuttle-GFP, som ligger i kärnan. Som en följd kan en Michaelis-Menten-liknande mättnadskurva för fluorescens-till-tiden-axeln, som representerar mängden nukleär shuttle-GFP vid vilken tidpunkt som helst, göras. Genom att använda den initiala linjära kurvhastigheten är det möjligt att generera en lutning, vilken representerar inmatningshastigheten i kärnan före fluorescensmättnad.
För att validera analysen, översättD C9orf72 dipeptidrepetitioner, poly (GR) och poly (PR), vilka tidigare har rapporterats för att störa nukleocytoplasmisk transport, användes 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Med hjälp av denna analys observerades en 50% minskning av nukleär importhastighet jämfört med kontrollen. Med hjälp av detta system kan små förändringar i nukleocytoplasmisk transport undersökas. Dessutom kan förmågan hos olika faktorer att rädda en nukleocytoplasmisk transportdefekt bestämmas.
Detta protokoll demonstrerar en mycket känslig och kvantitativ ny analys för att utvärdera små förändringar i nukleocytoplasmisk transport. Med detta system är det möjligt att observera och mäta nukleocytoplasmisk transport och dess dysfunktion i realtid, inte bara stora defekter som resulterar i dramatiska förändringar i proteinfördelning. Denna analys har inte bara en känslighetsfördel, men det kräver också lite förberedelse, är billigt och är en mycket enkel och låg engagemangsanalys.
<p class…The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar av AI-laboratoriet för deras hjälpsamma kommentarer och förslag. Vi skulle vilja tacka professor Mark Hipp (Max Planck Institute for Biochemistry) för att ge oss shuttle-GFP-vektorn. Detta arbete stöddes av bidrag från den israeliska vetenskapsstiftelsen (ISF # 124/14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) och National Institute for Psychobiology in Israel NIPI # b133-14 / 15).
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
Leptomycin B | Sigma | L2913 |
PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |