تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي
Summary
التفاعلات البروتين الحمض النووي ضرورية لعمليات بيولوجية متعددة. خلال تقييم الوظائف الخلوية، وتحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين لا غنى عنه لفهم تنظيم الجينات. الكروماتين مناعي (رقاقة) هو أداة قوية لتحليل هذه التفاعلات في الجسم الحي.
Abstract
العمليات الخلوية متعددة، بما في ذلك تكرار الحمض النووي وإصلاح، وإعادة التركيب الحمض النووي، والتعبير الجيني، تتطلب التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي. لذلك، الحمض النووي البروتين التفاعلات تنظيم وظائف فسيولوجية متعددة، الفيزيولوجية المرضية، والبيولوجية، مثل تمايز الخلايا، تكاثر الخلايا، ومراقبة دورة الخلية، واستقرار الكروموسوم، وتنظيم الجينات الوراثية، وتحول الخلايا. في خلايا حقيقيات النواة، يتفاعل الحمض النووي مع بروتينات هيستون و نونهيستون ويكثف إلى لونين. العديد من الأدوات التقنية يمكن استخدامها لتحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين، مثل الكهربائي (هلام) التنقل التحول الفحص (إمزا) و دناز I البصمة. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات تحليل التفاعل البروتين الحمض النووي في المختبر ، وليس ضمن السياق الخلوي. الكروماتين مناعي (رقاقة) هو الأسلوب الذي يلتقط البروتينات في مواقع محددة الحمض النووي ملزمة لها، مما يسمح لتحديد التفاعل الحمض النووي البروتينs داخل سياق الكروماتين. ويتم ذلك عن طريق تثبيت التفاعل الحمض النووي البروتين، تليها مناعي من البروتين من الفائدة. في وقت لاحق، والموقع الجيني الذي كان ملزما البروتين إلى يتميز. هنا، نحن تصف ومناقشة رقاقة وإظهار قيمته التحليلية لتحديد عامل النمو تحويل β (تغف-β) التي يسببها ملزمة لعامل النسخ SMAD2 إلى عناصر ملزمة سماد (سب) داخل منطقة المروج من التيروزين- بروتين كيناز كيت (c-كيت) مستقبلات يجند عامل الخلايا الجذعية (سف).
Introduction
في نواة حقيقيات النوى، يتفاعل الحمض النووي مع بروتينات هيستون والبروتينات غير المهيأة ويتم تكثيفها في لونين. في السياق الفسيولوجي، الفيزيولوجي المرضي، والخلية البيولوجية، يتم التحكم في الوظائف الخلوية مكانيا وبشكل مؤقت بواسطة التعبير الجيني المنسق بالكروماتين. التفاعلات الحمض النووي البروتين لها دور أساسي في تنظيم العمليات الخلوية، مثل تكرار الحمض النووي، وإعادة التركيب، والإصلاح، فضلا عن التعبير البروتين. ولذلك، فإن تحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين هو أداة لا غنى عنها في تقييم التعبير الجيني ووظيفة الخلية.
هناك العديد من التقنيات لتقييم التفاعلات الحمض النووي البروتين في المختبر ، مثل الكهربائي (هلام) التنقل التحول الفحص (إمزا) و دناز I البصمة 1 ، 2 . ومع ذلك، فإن هذه التقنيات لا تحليل التفاعل الحمض النووي للبروتين داخل لون الكروماتين والسياق الخلوي. تشيب iسا الذي يلتقط البروتينات ملزمة إلى مواقع محددة الحمض النووي ملزمة وبالتالي يسهل تحديد التفاعلات الحمض النووي البروتين داخل سياق لونين. وقد تم تطوير هذه التقنية في الأصل من قبل جيمور وليس لتقييم الحمض النووي الريبي بوليميراز إي ملزمة لجينات محددة في القولونية و دروسوفيلا ميلانوغاستر 3 ، 4 . ويتم ذلك عن طريق تثبيت المجمعات الحمض النووي البروتين، تليها أداء استخراج الكروماتين وقص الحمض النووي في ~ 200 زوج قاعدة (شظايا) شظايا. وفي وقت لاحق، يتم عزل البروتين المرتبط الحمض النووي من الفائدة التي كتبها إمونوبرسيبيتاتيون. بعد عكس الارتباط الحمض النووي البروتين، يتم تنقية الحمض النووي وتحليلها. ويمكن استخدام عدة طرق لتحليل مواقع ارتباط البروتين وتعتمد على تسلسل الحمض النووي من موقع ربط البروتين داخل الجين الهدف 5 . في الحالات التي يعرف فيها تسلسل الحمض النووي، بول القياسيةيمراس سلسلة ردود الفعل (ير) يمكن تطبيقها، وذلك باستخدام أزواج التمهيدي محددة يحيط موقع ملزمة معروفة. الكمي في الوقت الحقيقي ير (كرت-ير) ويمكن أيضا أن تستخدم 6 . في الحالات التي يكون فيها التسلسل غير معروف، يمكن دمج رقاقة مع ميكروأرس الحمض النووي (رقاقة على رقاقة)، تسلسل الحمض النووي (تشيب-سيق)، أو تقنيات الاستنساخ 7 ، 8 ، 9 .
مسار تغف-has لديه وظائف قوية قمع الورم وهو المسار الرئيسي في تمايز الخلايا. يتم تفعيلها من خلال ربط يجند-β1 يجند إلى مجمع مستقبلات مماثلة لها، مما أدى إلى سيرين فسفرة من عوامل النسخ SMAD2 / 3. بعد ارتباطها مع الوسيط المشترك، SMAD4، ترانزموكتس سماد معقدة إلى النواة ويربط سب في منطقة المروج من الجينات المستهدفة، حيث ينظم الجينات التي تسيطر على دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، و ديفيرنتياتي الخليةعلى. الاستجابة النسخي للتحفيز تغف-is هو نوع الخلية والسياق محددة 10 . في الآونة الأخيرة، وصفنا حلقة ردود فعل إيجابية بين تغف-β ومسار C-كيت 11 . في هذا النموذج، تغف-β1 المنشط SMAD2 يربط إلى ج- كيت يجند المروج ويحفز التعبير عنها وإفرازها. في وقت لاحق، يجند C-كيت ينشط مستقبلات C-كيت بطريقة السيارات و شبه كرينيك. ج-كيت تنشيط مستقبلات النتائج في STAT3 تير 705- الفسفرة عبر JAK1 / 2. بعد STAT3 التنشيط والترجمة النووية، STAT3 يربط الجين يجف-β1 يجند وينظم التعبير عنها.
هنا، علينا أن نبرهن على الدور الأساسي لتحليل رقاقة لتحديد SMAD2 ملزمة إلى ج-كيت مستقبلات يجند المروج وتحديد محول إشارة (و) المنشط (من) النسخ 3 (STAT3 ملزمة ل تغف-β1- الجينات).
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا التقرير، ونحن نبرهن على تغف-β1 ملزمة من SMAD2 إلى سب داخل المروج يج-كيت و TGF- β1 التي يسببها ملزمة STAT3 إلى تسلسل الاعتراف بها داخل الجين يجند-β1 يجند. علينا أن نظهر السيتوكين الناجم عن ملزمة كل من عوامل النسخ باستخدام لونين مناعي.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جامعة تكساس مركز مد أندرسون للسرطان، هيوستن، تكس (صناديق بدء التشغيل، بب).
Materials
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
| TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
| Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
| Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
| ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
| Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
| PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
| PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
| PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
| PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |
References
- Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).
- Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).
- Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26 (1), 37-47 (2002).
- Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).
- Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).
- Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94 (5), 585-594 (1998).
- Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).
- Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).
- Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).
