Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Summary

As interações DNA-proteína são essenciais para múltiplos processos biológicos. Durante a avaliação das funções celulares, a análise das interações DNA-proteína é indispensável para a compreensão da regulação gênica. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma poderosa ferramenta para analisar essas interações in vivo.

Abstract

Múltiplos processos celulares, incluindo replicação e reparo de DNA, recombinação de DNA e expressão gênica, requerem interações entre proteínas e DNA. Portanto, as interações DNA-proteína regulam diversas funções fisiológicas, fisiopatológicas e biológicas, como a diferenciação celular, proliferação celular, controle do ciclo celular, estabilidade cromossômica, regulação de genes epigenéticos e transformação celular. Em células eucarióticas, o DNA interage com proteínas de histonas e não-histonas e é condensado em cromatina. Várias ferramentas técnicas podem ser usadas para analisar as interações DNA-proteína, como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I. No entanto, essas técnicas analisam a interação proteína-DNA in vitro , não dentro do contexto celular. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é uma técnica que captura proteínas em seus locais específicos de ligação ao DNA, permitindo assim a identificação da interação DNA-proteínaS dentro do contexto da cromatina. É feito por fixação da interação DNA-proteína, seguida de imunoprecipitação da proteína de interesse. Posteriormente, o sítio genômico com o qual a proteína estava ligada caracteriza-se. Aqui, descrevemos e discutimos ChIP e demonstram seu valor analítico para a identificação da ligação induzida pelo Fator de Crescimento Transformante-β (TGF-p) do fator de transcrição SMAD2 para elementos de ligação SMAD (SBE) dentro da região promotora da proteína tirosina- Fator de células-tronco do ligando do receptor de proteína quinase Kit (c-KIT) (SCF).

Introduction

No núcleo de eucariotas, o DNA interage com proteínas histonas e proteínas não-histônicas e é condensado em cromatina. No contexto fisiológico, fisiopatológico e biológico, as funções celulares são controladas espacialmente e temporariamente pela expressão de genes coordenados com cromatina. As interações DNA-proteína têm um papel essencial na regulação dos processos celulares, como a replicação, recombinação e reparo do DNA, bem como a expressão protéica. Portanto, a análise das interações DNA-proteína é uma ferramenta indispensável na avaliação da expressão gênica e da função celular.

Existem várias técnicas para avaliar as interações DNA-proteína in vitro , como o Ensaio de Mudança de Mobilidade de Eletroforese (gel) (EMSA) e a pegada DNase I ^{1 , 2} . No entanto, essas técnicas não analisam a interação proteína-DNA dentro da cromatina e do contexto celular. ChIP iUma técnica que captura proteínas ligadas aos seus locais de ligação de ADN específicos e, assim, facilita a identificação de interações DNA-proteína dentro do contexto da cromatina. A técnica foi originalmente desenvolvida por Gimour e Lis para avaliação da ligação da ARN polimerase II a genes específicos em Escherichia coli e Drosophila melanogaster ^{3 , 4} . É feito por fixação dos complexos DNA-proteína, seguido de extração de cromatina e corte do DNA em ~ 200 fragmentos de pares de bases (pb). Posteriormente, a proteína de interesse do DNA de interesse é isolada por imunoprecipitação. Após a reversão da reticulação de proteína de DNA, o DNA é purificado e analisado. Podem ser utilizados vários métodos para a análise dos sítios de ligação à proteína e dependem da sequência de ácido nucleico do sítio de ligação à proteína dentro do gene alvo ⁵ . Nos casos em que a sequência de DNA é conhecida, Pol padrãoReações de cadeia de imerase (PCR) podem ser aplicadas, utilizando pares de iniciadores específicos que flanqueiam o site de ligação conhecido. A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) também pode ser usada ⁶ . Nos casos em que a seqüência é desconhecida, o ChIP pode ser combinado com microarrays de DNA (ChIP-on-chip), sequenciação de DNA (ChIP-seq) ou técnicas de clonagem ^{7 , 8 , 9} .

A via TGF-β possui potentes funções de supressão de tumores e é uma via chave na diferenciação celular. É ativado através da ligação do ligando de TGF-p1 ao seu complexo de receptores cognatos, resultando na fosforilação de serina de fatores de transcrição SMAD2 / 3. Após a sua associação com o mediador comum, SMAD4, o complexo SMAD se transloca para o núcleo e se liga ao SBE dentro da região promotora dos genes alvo, onde regula os genes que controlam o ciclo celular, a apoptose e a diferenciação celular.em. A resposta transcricional à estimulação de TGF-β é de tipo celular e específica do contexto ¹⁰ . Recentemente, descrevemos um loop de feedback positivo entre TGF-β e a via C-KIT ¹¹ . Neste modelo, o SMAD2 activado por TGF-β1 liga-se ao promotor do ligando c-KIT e induz a sua expressão e secreção. Posteriormente, o ligando c-KIT activa o receptor c-KIT de forma auto-para-crinica. A ativação do receptor c-KIT resulta em STAT3 Tyr ⁷⁰⁵ -fosforilação via JAK1 / 2. Após a ativação STAT3 e a translocação nuclear, STAT3 se liga ao gene do ligando TGF-β1 e regula sua expressão.

Aqui, demonstramos o papel essencial da análise de ChIP para a identificação da ligação de SMAD2 ao promotor do ligando do receptor c-KIT e para a identificação do Transdutor de sinal (e) Activador (da) Transcrição 3 (ligação de STAT3 ao TGF-β1- gene).

Protocol

1. Preparação de soluções Prepare as seguintes soluções frescas para cada experiência. Para a solução de fixação , prepare 37% de formaldeído e guarde-o à RT. Dilúcle-o em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 1,42%. CUIDADO: O formaldeído é classificado como irritante, corrosivo, mutagênico, teratogênico e cancerígeno. Não ingerir. Não respire gases / fumaça / vapor / spray. Em caso de ventilaç…

Representative Results

A ligação do ligando de TGF-p1 ao seu complexo de receptor cognato resulta na fosforilação de serina de fatores de transcrição de SMAD2 / 3, seguidos de sua associação com o mediador comum, SMAD4. O complexo SMAD se transloca para o núcleo. O TGF-p pode regular a transcrição do gene, quer directamente através da ligação do SMAD aos SBEs dentro das regiões reguladoras dos genes alvo, quer indirectamente através da expressão regulada por SMAD de activadores transcricionais…

Discussion

Neste relatório, demonstramos a ligação induzida por TGF-β1 de SMAD2 a um SBE dentro do promotor do ligando c-KIT e à ligação induzida por TGF-p1 de STAT3 à sua sequência de reconhecimento dentro do gene do ligando TGF-β1. Demonstamos ligação induzida por citocinas de ambos os fatores de transcrição usando imunoprecipitação com cromatina.

A imunoprecipitação da cromatina é uma ferramenta poderosa para demonstrar a ligação direta de uma proteína de interesse para o DNA, …

Materials

HepG2 cells	ATCC	HB-8065
Hep3B cells	ATCC	HB-8064
TGF-β1	R&D Systems	101-B1	Used at a concentration of 10 ng/ml
Anti-SMAD2 antibody	Cell Signalling Technology	5339	Amount used per IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody	Cell Signalling Technology	4904	Amount used per IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads	Active Motif	53033
Protease Inhibitor Cocktail	Active Motif	37490
Micrococcal Nuclease	Cell Signalling Technology	10011
PCR forward primer: PAI-1			Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1			Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF			Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’
PCR reverse primer: SCF			Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1)			Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1)			Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2)			Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2)			Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’