使用高尔基Cox方法评估老年小鼠海马树突状复杂性
Summary
这里我们详细介绍一种高尔基体Cox协议。这种可靠的组织染色方法允许对海马中的细胞结构和整个大脑进行高质量的评估，同时进行最少的故障排除。
Abstract
树枝状突起是包含兴奋性突触的神经元树突状突起。海马内神经元树突的形态和分支变化涉及认知和记忆形成。有几种高尔基染色方法，所有这些方法都可用于确定树突状乔木的形态特征并产生清晰的背景。目前的高尔基Cox方法（商业高尔基染色试剂盒提供的方案略有变化）被设计用于评估相对较低剂量的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）如何影响树突状形态，脊柱数量以及海马内部植树的复杂程度。 5-Fu以区域特异性方式显着调节树突状复杂性并降低整个海马的脊柱密度。数据显示，高尔基染色法对CA1，CA3和海马齿状回（DG）中的成熟神经元进行了有力的染色。该协议报告每个步骤的细节，以便其他研究人员能够以高质量的结果和最少的故障排除，可靠地在整个大脑中染色组织。
Introduction
树突状体是接收和处理突触前输入的神经元的最大部分1 。它们的树突过程具有复杂的几何形状，其中近端分支具有比远端分支更大的直径。当树突发育时，它们在称为树突状树突的过程中与其他神经元形成几个连接。这种分支的程度和模式决定了树突可充分处理的突触输入量2 。
树突状晶化是活性依赖性可塑性和神经元回路适当发育的必需过程。延伸，收缩，分支和突触发生是复杂的过程，包括内在遗传程序和外在因素的影响。海马内神经元树突的形态和分支变化涉及认知和记忆形成3，4 ，树突状复杂性的改变与病理生理和行为变化有关5 ，异常与多种疾病状态有关，包括脆性X综合征和唐氏综合征6 。
树枝状刺是树突状乔木的特殊亚细胞层，在中枢神经系统内接受兴奋性输入。有三种形态类型的树突棘，每个类的名称根据其大小和形状：1）蘑菇棘，具有比其他刺7更复杂的突触后密度，具有更多的谷氨酸受体; 2）粗短的刺，缺乏茎;和3）薄刺，由长而窄的茎和球状头组成。树突状体积部分地用于限定它们，其中薄脊通常较小（0.01μm3 </sup>）与蘑菇刺（0.8μm3） 9,10比较 。脊椎稳定成熟。例如，薄的脊椎在几天之后缩回或发展成蘑菇刺。或者，蘑菇棘相对稳定并且可以长时间存活。神经元连接的强度被认为是基于刺的数量和/或其体积11,12,13 。
古典高尔基染色方法及其更现代的变化对于检查树突棘形态和密度都是有用的。高尔基染色的一个独特之处在于它随机染色了约5％的总神经元，这允许追踪个体神经元14,15 。虽然高尔基甲基的确切机制od染色单个神经元尚未知，该方法的原理是基于铬酸银（Ag 2 CrO 4 ）的结晶16,17 。高尔基方法有三种主要类型：快速高尔基体，高尔基体细胞，高尔基 – 科罗奇18，19 。所有这三种方法从铬盐的初始孵化阶段开始数天至数月，但它们之间存在一定的关键差异。快速高尔基体在第一步使用四氧化锇，而高尔基Kopsch包括多聚甲醛。随后在1-2％硝酸银溶液中孵育约7天，在快速高尔基体和高尔基体系中进行染色。高尔基Cox法使用氯化汞和重铬酸钾代替硝酸银，浸渍时间为2-4周。然后将组织切片并快速置于稀释的氨中溶液，然后用照相定影剂除去盐。在三种类型中，高尔基Cox方法被认为是在没有太多背景干扰下染色树枝状树枝的最佳方法，部分原因是因为晶体表面不会发生在组织表面（不像快速高尔基法） 17，20，21 。
本方法是商业高尔基染色试剂盒提供的方案的轻微变化，并且设计用于评估相对低剂量的5-Fu如何影响树突状态特征和脊柱密度。获得的任何数据可以进一步了解化学治疗如何影响神经元电路。
Protocol
Representative Results
Discussion
与更现代的技术相比，高尔基Cox方法具有几个优点，使其成为检查脊柱形态的首选方法：1）染色可用于基本上任何组织，2）基本的光学显微镜设置是所有需要的获得基于高尔基体的图像，3）高尔基Cox成像比共焦成像更快; 4）高尔基染色切片比荧光标记的样品长达数月至数年。即使有这些优点，高尔基Cox方法仍然有一定的局限性。首先，整个过程非常耗时，需要几周的染色，然后分析图像。如本?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到NIH P20 GM109005（ARA）和转化神经科学中心IDeA计划奖P30 GM110702的试点资助。
Materials
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
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