Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları
Summary
Sıçan kauda epididimidlerinden primer dissosiye epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini ölçmek için hücre izolasyonunu ve tam hücreli yama klemp kayıtlarını birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, primer epididimal epitel hücrelerinin işlevsel özelliklerinin araştırılmasına ve epididimin fizyolojik rolünün aydınlatılmasına izin verir.
Abstract
Epididimis, sperm olgunlaşması ve üreme sağlığı için vazgeçilmez bir organtır. Epididimal epitel, moleküler ve morfolojik özelliklerde değil aynı zamanda fizyolojik özelliklerde de farklı olan karmaşık bağlanmış hücre tiplerinden oluşur. Bu farklılıklar, epididimal lümende post-testiküler sperm gelişimi için gerekli mikro ortamı birlikte kuran çeşitli işlevlerini yansıtmaktadır. Epididimal epitel hücrelerinin biyofiziksel özelliklerinin anlaşılması, hem fizyolojik hem de patofizyolojik koşullar altında sperm ve üreme sağlığında işlevlerini ortaya çıkarmak açısından önemlidir. Fonksiyonel özellikleri henüz tam olarak aydınlatılamamış olsa da, epididimal epitel hücreleri hücresel olayları ve tekli hücrelerin zar özelliklerini ölçmek için kullanılan bir araç olan patch-clamp tekniği kullanılarak incelenebilir. Burada, hücre izolasyonu ve mezaya tüm hücre yama-kelepçe kayıt yöntemlerini anlatacağızSıçan kauda epididimitlerinden primer dissosiye epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini kontrol edin.
Introduction
Erkek üreme kanalındaki epididim, bir mozaik epitel hücresi tabakasıyla kaplı bir organtır. Diğer epitel dokularında olduğu gibi, epididimal epitelin çeşitli hücre tipleri, temel hücreler, berrak hücreler, bazal hücreler ve immünolojik ve lenfatik sistemlerdeki hücreler de dahil olmak üzere, uyumlu bir şekilde çalışırlar ve tüp ön hattında bariyer olarak işlev görürler. Sperm maturasyonu ve fizyolojisi için destekleyici hücreler 1 , 2 , 3 . Böylece, bu epitel hücreleri üreme sağlığında önemli bir rol oynamaktadır.
Epitelyal hücreler, voltaj kapılı Na + veya Ca 2+ kanalları 4 , 5'in yokluğundan dolayı depolarize edici uyaranlara yanıt olarak tamamen veya hiç aksiyon potansiyelleri oluşturamayan uyarılmayan hücreler olarak genelde kabul edilir. Bununla birlikte, epitelyal hücreler uni ifade ederQue iyon kanalları ve taşıyıcıları, salgı ve besleyici ulaşım gibi özel fizyolojik rollerini düzenler. 6 . Dolayısıyla farklı epitel hücreleri karakteristik elektriksel özelliklere sahiptir. Örneğin, başlıca hücreler, sıvı ve klorür taşınması için CFTR'yi ifade eder ve TRPV6'yı kalsiyum yeniden emilim için ekspres eder, buna karşın berrak hücreler lümen asidifikasyonu için 1 , 7 , 8 , 9 nolu proton pompa V-ATPaz'ını ifade eder. Epididimal epitel hücrelerin fizyolojik özelliklerini düzenleyen bazı taşıyıcı ve iyon kanalları rapor edilmiştir, ancak epididimal epitel hücrelerinin fonksiyonel özellikleri büyük ölçüde yapılmamış 10, 11, 12, 13 ile anlaşılmış değildir.
WhOle hücreli patch-clamp kayıt, hem uyarılabilir hem de uyarılmayan hücrelerin içsel özelliklerini incelemek için iyi bilinen bir tekniktir ve özellikle heterojen hücre numunelerinde ayrışmış hücrelerin işlevlerini incelemek için yararlıdır; Voltaj kelepçesi pasif membran özelliklerini ve tek hücrelerin 14 , 15 iyonik akımlarını ölçmek için kullanılır. Pasif membran özellikleri arasında giriş direnci ve kapasitans bulunur. Birinci parametre, hücre membranının yüzey alanını (iyon kanalları ve taşıyıcıların bulunduğu, hücre dışı ve hücre içi ortamı ayıran ince bir izolatör görevi gören bir fosfolipid çift katmanı) ima ettiğinde, iç membran iletkenliğini gösterir. Membran kapasitansı hücre zarı yüzey alanı ile doğru orantılıdır. Giriş direnci tarafından yansıtılan membran direnci ile birlikte, membran zaman sabiti, wHücre membran potansiyelinin iyon kanal akımlarının akışına ne kadar hızlı tepki verdiğini gösterir, belirlenebilir. Bu bağlamda, hücrelere uygulanan bir dizi voltaj kademesinden gelen akım yanıt karakteristiklerinin birleştirilmesiyle, hücrelerin biyofiziksel kinetiği ve özellikleri 15 , 16 , 17 , 18 olarak belirlenmiştir .
Bu yazıda, fare kauda epididimisindeki epitel hücrelerinin izole edilmesi için prosedürleri ve tüm hücre yama kelepçesini kullanarak ayrışmış hücre karışımı içindeki farklı hücre tiplerinin membran özelliklerini ölçmek için gerekli adımları açıkladık. Epididimal ana hücrelerin farklı membran elektrofizyolojik özelliklerini sergilediğini ve iletkenliklerin diğer hücre türlerinden kolayca tespit edilebileceğini gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde sıçan kauda epididimidlerinin enzimatik dağılımı sürekli olarak sağlıklı epitel hücreleri vermiştir. Yama-kelepçe deneyleri için epididimal epitel hücrelerinin kalitesi protokolde birkaç kritik adıma bağlıdır. Örneğin, düşük bir santrifüj kuvveti (30 xg) ile hücre karışımının santrifüjlenmesi, spermatozoa ve epididimal luminal içeriğin giderilmesi için önemlidir; Epididimal epitel hücreleri, hücre kültüründe spermatozoa varlığında sağlıksız hale gelir. Ek ola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Metin hakkında faydalı yorumlar için Dr. Christopher Antos'a teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, ŞangayTech Üniversitesi'nden Winnie Shum'a verilen start-up finansmanı ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NNSFC 31471370) finansman ile desteklenmiştir.
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
