우리는 쥐 cauda epididymides에서 일차 해부 상피 세포의 전기적 특성을 측정하기 위해 세포 격리와 whole-cell patch-clamp recording을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 epididymis의 생리적 인 역할을 더 해명하기 위해 원발성 부고환 상피 세포의 기능적 특성을 조사 할 수있게합니다.
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이 논문에서
요약
초록
부고환은 정자 성숙과 생식 건강에 필수적인 기관입니다. 부고환 상피 세포는 분자와 형태 학적 특징뿐 아니라 생리 학적 특성에서도 뚜렷한 복잡하게 연결된 세포 유형으로 구성됩니다. 이러한 차이점은 부고환 내강에서 사후 정자의 발달에 필요한 미세 환경을 함께 구성하는 다양한 기능을 반영한다. 부고환 상피 세포의 생리 학적 특성에 대한 이해는 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건 하에서 정자 및 생식 건강에서의 기능을 밝히는데 중요하다. 그들의 기능적 특성은 아직 완전히 밝혀지지는 않았지만, 부고환 상피 세포는 단일 세포의 세포 성질 및 막 특성을 측정하기위한 도구 인 패치 클램프 기술을 사용하여 연구 할 수있다. 여기서 우리는 세포 분리 및 전체 세포 패치 클램프 기록 방법에 대해 설명합니다쥐 cauda epididymides에서 일차 분리 된 상피 세포의 전기적 특성을 확인하십시오.
서론
남성 생식 기관의 부고환은 모자이크 상피 세포 층이 늘어서있는 기관입니다. 다른 상피 조직에서와 마찬가지로, 주요 세포, 클린 세포, 기저 세포 및 면역계 및 림프계로부터의 세포를 포함하는 부고환 상피의 다양한 세포 유형은 세관 최전선에서 장벽으로서 기능하도록 협조 된 방식으로 작용하며, 정자 성숙 및 생리학을위한 세포 지원 1 , 2 , 3 . 따라서 이러한 상피 세포는 재생산 건강에 필수적인 역할을합니다.
상피 세포는 일반적으로 전위가없는 Na + 또는 Ca 2+ 채널이 없기 때문에 탈분극 자극에 반응하여 모든 또는 전혀 작용하지 않는 전위를 생성 할 수없는 비 흥분성 세포로 간주됩니다 4 , 5 . 그러나, 상피 세포는 유니분비 및 영양소 운반과 같은 전문화 된 생리적 인 역할을 조절하는 이온 채널 및 운반자 세트 6 . 따라서 상이한 상피 세포는 특징적인 전기적 특성을 갖는다. 예를....
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프로토콜
모든 동물 실험은 지역 및 국제 요구 사항을 충족하는 ShanghaiTech University 기관 동물 사용 및 사용위원회의 지침에 따라 수행됩니다.
1. 실험 동물
- 8-12 주 사이에 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐 (~ 300-450 g)를 사용하십시오. 쥐의이 나이에, 정자는 cauda epididymides에 도착했습니다.
2. 쥐 Cauda Epididymides에서 상피 세포의 분리
참고 : 달리 명시되지 않는 한 무균 조건에서 다음 단계를 수행합니다.
- 해부기구 및 시약 준비
- 해부 도구를 70 % 에탄올에 담가 소독하고 공기를 건조하게하십시오.
- 온난 욕을 켜십시오 (32 ° C); 1 % (v / v) 항체가 보충 된 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 배지 (RPMI) 500 mL를 준비하고 예열하십시오.tic (100 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 최종 스트렙토 마이신)로 표지하고 "RPMI (+ P / S 1 : 100)"로 표시 하였다. 깨끗한....
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결과
래트의 카우 epididymides에서 상피 세포의 분리 기술의 효소 분해 과정은 이전 연구 9, 12에서 수정 된 프로토콜이다. 이 방법은 90 % 이상의 생존력과 표면 수포 나 부어 오름이없는 단일 세포의 혼합물을 생성합니다. 이질적인 세포 혼합물은 이전에 설명한 바와 같이 주로 주요 세포, 맑은 세포 및 기저 세포로 구성됩니다 1 . 이 프로토콜에서는, 부고화 상피 세포의 비교적 순수한 샘플은 접시에 비 상피 세포 (예 : 섬유 아 세포와 부드러운 세포)의 접착을 허용하기 위해 페트리 접시에 하룻밤 일차 해리 세포를 배양하여 얻을 수 있습니다 그림 1A (수확 전)에 나와 있습니다. 세포 유형은 현미경으로 그들의 표현형에 의해 예비 적으로 구별 될 수있다그들의 특정.......
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토론
이 프로토콜에서, 쥐 cauda epididymides의 효소 분산 일관되게 건강한 상피 세포를 생산. 패치 - 클램프 실험을위한 부고환 상피 세포의 품질은 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 달려있다. 예를 들어, 낮은 원심력 (30 xg)에서 세포 혼합물의 원심 분리는 정자 및 부고환 내강을 제거하는 데 중요합니다. 부고환 상피 세포는 세포 배양에서 정자가 있으면 건강하지 못하게된다. 또한, 해리 된 세포 혼합물을 페트리 접시에서 수 시간 동안 배양하는 것은 섬유 아세포 및 평활근 세포를 제거하기위한 중요한 단계이다; 비 - 상피 세포는 배양 접시에서 더 빨리 부착하여 현탁액에 상피 세포를 남겨 두며 상피 세포는 부드러운 흡인으로 다시 수확 할 수 있습니다. 또한 콜라게나 제 소화 및 미세 유리 피펫으로 분쇄하는 것은 두 가지 중요한 단계입니다.세포 분리 절차 동안 단일 세포. 마지막으로 부고환 세포의 효소 소화는 패치 - 클램프 실험에 중요하다. 왜냐하면 비효율적 인 효소 활성에 의한 과소 소화 또는 장기간 배양에 의한 과.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
본문에 대한 도움이되는 의견을 보내 주신 크리스토퍼 안토 스 박사님 께 감사드립니다. 이 작품은 위니 award에게 수여 된 상하이 테크 대학교 (ShanghaiTech University)로부터의 창업 자금과 중국 국립 자연 과학 재단 (NNSFC no. 31471370)의 자금 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | 분자 장치 - Axon | Multiclamp 700B 패치 클램프 증폭기 | |
| 디지털 수집 시스템 | 분자 장치 - Axon | Digidata 1550 컨버터 | |
| 현미경 | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| 녹음 챔버 및 인라인 히터 | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB 이중 | |
| 현미경 | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| 녹음 챔버 및 인라인 히터 | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| 녹음 챔버 | 워너 인스트루먼트 | RC-26G 또는 집에서 만든 챔버 | |
| 보로실리케이트 모세관 유리와 필라멘트 | 셔터 악기 / 하버드 장치 | BF150-86-10 | |
| 진동 절연 테이블 | TMC | 63544 | |
| 디지털 Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| 강력한>분리용 시약 | |||
| RPMI 1640 매체 | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 2005년 30월 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-&-alpha;-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| 소 태아 혈청 | 염소자리 | FBS-12A | |
| Micropipette 내부 용액 (K + 기반 용액) (pH 7.2, 280-295 mOsm) < / strong> | |||
| KCl, 35mM | Sigma / 다양한 | V900068 | |
| MgCl2< / sub> · 6H 2 < / sub>O, 2mM | Sigma / 다양한 | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma / 다양한 | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma / 다양한 | V900477 | |
| K-글루코네이트, 100mM | 시그마/다양한 | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | 시그마< | A9187 | |
| 강>표준 외부 기록 생리염 용액(PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | 시그마/다양한 | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | 시그마 / 다양한 | V900068 | |
| CaCl 2,< / sub> 2.5mM | 시그마 / 다양한 | V900266 | |
| MgCl 2 < / sub> · 6H 2 < / sub>O, 1.2mM | Sigma / 다양한 | M2393 | |
| NaH 2< / sub>PO4, 1.2mM | Sigma / 다양한 | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma / 다양한 | V900477 | |
| 포도당, 10mM | 시그마 / 다양한 | V900392 | |
| < 강>pH 조정 용< / 강> | |||
| NaOH | 시그마 / 다양한 | V900797 | 순도 > = 97 % |
| KOH | 시그마 / 다양한 | 60371 | 순도 > = 99.99 % |
참고문헌
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J.....
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